[發(fā)明專利]一種大麥脂肪氧化酶(LOX-1)合成缺陷基因的多態(tài)性分子標(biāo)記方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210441696.2
• 申請(qǐng)日: 2012-11-08
• 公開（公告）號(hào): CN103114129A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭剛剛;張京;張?jiān)葡?/a>;周芝輝;袁興淼
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種大麥脂肪氧化酶(LOX-1)合成缺陷基因的多態(tài)性分子標(biāo)記方法，其特征在于包括以下步驟：對(duì)大麥種質(zhì)資源進(jìn)行磨粉和酶液粗提，并用化學(xué)顯色的方法進(jìn)行LOX-1活性鑒定，篩選出LOX-1活性缺失的自然變異材料，設(shè)計(jì)基因特異性引物，對(duì)自然變異和活性正常材料的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和克隆測序，最終確定導(dǎo)致LOX-1活性缺失的突變位點(diǎn)；同時(shí)，從發(fā)芽后的大麥組織中提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，對(duì)上述功能突變材料的LOX-1基因進(jìn)行測序，并將篩選出的目的基因進(jìn)行序列比對(duì)和功能缺失原因分析，進(jìn)一步開發(fā)出改功能位點(diǎn)的多態(tài)性分子標(biāo)記，其中基因組DNA測序引物為：

Lox1.1?GTCCGATCCATCTCTCCAAA?TCGATCTGCACCAAACCATA

Lox1.2?CTTTCATTTTCACCGCCTTC?GGCACGTAGATCTGCTCCA

Lox1.3?CGCTACGACGTCTACAACGA?GCGCGTTTCAATCAATCATA

Lox1.4?GTACGTTCTCCACGGTCGAT?AGCAATTCGTTCCGCTTAAA

cDNA克隆測序引物：

Lox1.FL1?AGCAGTGAAAGCGAGGAGAG?TGATGGAGTAGCCCAGGAAG

Lox1.FL2?CGCCAACTCATGGATCTACC?GAACGCCCTTTATTCATCCA

SNP鑒定引物：

RNR?CACTAGTGATTCTGCGAGTGTGGAGCCC

RNF?AAAACATAACTTTTTAATAGTAATGTTGCAC。

2.如權(quán)利要求1所述的一種大麥脂肪氧化酶(LOX-1)合成缺陷基因的多態(tài)性分子標(biāo)記方法，其特征在于：所述的化學(xué)顯色方法為：稱取大麥粉溶蒸餾水中，混合均勻后離心，取上清至另一離心管中；向離心管中一次加A溶液，反應(yīng)20分鐘，再加入的B溶液反應(yīng)10分鐘，最后用SDS終止反應(yīng)，如果離心管中呈深藍(lán)色，表明LOX-1活性正常，如果呈現(xiàn)淺藍(lán)或者無色，表明LOX-1活性低或者無活性，其中反應(yīng)溶液A：10ml?20mmDMAB/100mm磷酸緩沖液，0.4ml?25mm亞油酸底物和9.6ml雙蒸水；反應(yīng)溶液B：0.4ml?10mm?MBTH，0.4ml?5mg/ml血紅蛋白，19.2ml雙蒸水。

3.如權(quán)利要求1或2所述的一種大麥脂肪氧化酶(LOX-1)合成缺陷基因的多態(tài)性分子標(biāo)記方法，其特征在于：區(qū)分純合和雜合突變位點(diǎn)，能夠用于優(yōu)質(zhì)新品種選育的分子標(biāo)記輔助選擇，實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助進(jìn)行大麥品質(zhì)改良的育種目標(biāo)上的應(yīng)用。?