[發明專利]一種大麥脂肪氧化酶(LOX-1)合成缺陷基因的多態性分子標記方法

有效

• 申請號: 201210441696.2
• 申請日: 2012-11-08
• 公開（公告）號: CN103114129A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發明（設計）人: 郭剛剛;張京;張云霞;周芝輝;袁興淼
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院作物科學研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種大麥脂肪氧化酶(LOX-1)合成缺陷的基因變異及其應用。

背景技術

以脂肪氧化酶(Lipoxygenase，LOX)為核心的脂質降解途徑是影響以大麥為主要原料的諸如啤酒等飲料的風味的一項重要因素，同時，也是導致谷物儲藏期間品質變劣、產生陳味的根源。在啤酒工業中，反式-2-壬烯醛(T2N)是由脂質降解產生的一種典型的風味老化物質，被認為是啤酒老化的指示劑，嚴重影響啤酒長期儲存的商品性(劉明麗等2011，釀酒科技5：98-102)。在脂質降解途徑中，脂肪氧化酶分別將亞油酸轉化為9-氫過氧化十八碳二烯酸(9-HPOD)和13-氫過氧化十八碳二烯酸(13-HPOD)的雙加氧作用。在釀酒工業中，9-HPOD為主要的脂肪氧化酶通路代謝產物，通過進一步酶促或自發反應導致反式-2-壬烯醛(T2N)的產生(Kuroda等2003，Biosci?Biotechnol?Biochem?67：691-697)。在谷物儲藏過程中，脂肪氧化酶促進氧元素與多鏈不飽和脂肪酸結合，形成雙鏈的氫過氧化物，進一步轉變成一些揮發性的醛、酮類氣體化合物，從而導致谷物變質和變味；缺失脂肪氧化酶的稻米與未缺失的品種相比耐儲藏性更好，同時品質、發芽率更高，蟲害率更低(Zhang等2007，Journal?of?Stored?Products?Research?43：87-91)。目前，大麥中已知有3個脂肪氧化酶基因(Lox-1或LoxA，Lox-2或LoxC以及Lox-3或LoxB)(Van?Mechelen等1999，Plant?Mol?Biol.39(6)：1283-1298)，其中Lox-1是影響大麥麥芽脂肪氧化酶活性的主要基因(Kuroda等2005，EBC?Congress，750-756)。已有報道稱，經通過人工誘變獲得的LOX-1基因失活的變異(US20030167544A1)，此外還有篩選種質資源發掘到的自然變異(Hirota等2005，Theor?Appl?Genet，111：1580-1584)，并隨即用于高品質啤酒大麥新品種的選育。研究表明，這些LOX-1基因失活的大麥原料均可顯著降低啤酒中T2N的含量，經過長時間儲存也不會顯著增加，從而保證啤酒風味不發生改變(US20090285932A1)。目前丹麥嘉士伯啤酒公司以及日本札幌啤酒有限公司已分別經過人工化學誘變以及篩選自然的LOX-1基因合成缺陷型突變體，并對相關基因變異申請了專利保護。

發明內容

針對上述現有技術的缺點，本發明從中國大麥品種中發掘出的LOX-1合成缺陷型自然變異，位于第二內含子中，與其他已有報道的變異位點均不屬于同一位點，為新的基因變異類型，且已同步開發出特異的功能性分子標記用于輔助快速育種。

為實現本發明的目的，從大麥種質資源中篩選獲得脂肪氧化酶活性缺失的自然變異材料，進一步獲得LOX-1基因突變位點，并開發相應的單核苷酸多態性分子標記(SNP?Marker)。具體地說，對1000份原產于我國的大麥種質資源進行磨粉和酶液粗提，并用化學顯色的方法進行LOX-1活性鑒定，最終篩選出LOX-1活性缺失的自然變異材料。根據已經報道的LOX-1基因序列，設計基因特異性引物，對自然變異和活性正常材料的基因組DNA進行PCR擴增和克隆測序，最終確定導致LOX-1活性缺失的突變位點；同時，從發芽后的大麥組織中提取mRNA，反轉錄為cDNA，對上述功能突變材料的LOX-1基因進行測序，并將篩選出的目的基因進行序列比對和功能缺失原因分析。進一步開發出改功能位點的多態性分子標記，實驗驗證該分子標記用于輔助育種的可靠性和有效性。

大麥粗提蛋白的脂肪氧化酶活性分析結果顯示，第二內含子中642bp處的單個堿基突變(G型)的大麥種質資源LOX-1活性缺失，而對照的正常的野生型(C型)則表現為活性正常，說明這是進行LOX-1活性缺失大麥新品種選育的新的基因資源。

此外，本發明通過開發該SNP位點的特異性分析標記，可用于分子標記輔助育種。采用LOX-1活性缺失的啤酒大麥原料，能夠使釀酒者生產出即使經長期儲藏，T2N特異性的陳腐異味水平也不明顯增加的啤酒；并能夠輔助培育耐儲藏的高品質食用大麥(青稞)和飼用大麥新品種。

附圖說明

圖1為LOX-1活性缺失材料的篩選示意圖

圖2為大麥脂肪氧化酶基因LOX-1的基因結構及其功能變異位點

樣品1～4為大麥LOX-1活性缺失型大麥品種(G型)；5-8為活性正常大麥品種(C型)

圖3為Lox1基因組第二內含子單堿基變異導致內含子剪切位點改變示意圖