[發(fā)明專利]一種表達羰基還原酶的重組工程菌及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210440849.1
• 申請日: 2012-11-07
• 公開（公告）號: CN103013898A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設計）人: 金志華;胡升;楊岳微;姚成志;王愛珂;金慶超;楊郁;梅樂和;高然
• 申請（專利權）人: 寧波美諾華藥業(yè)股份有限公司;浙江大學寧波理工學院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P17/00;C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發(fā)明涉及一種重組工程菌株，尤其涉及一種表達羰基還原酶的重組工程菌及其應用。?

背景技術

度洛西汀(duloxetine)，化學名為(+)-(S)-N-甲-γ-基-(1-萘氧基)-2-噻吩基鹽酸，是欣百達(cymbalta)的有效成分。它是一種5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NE)再攝取的雙重抑制藥，通過增加突觸間隙中5-羥色胺和去甲腎上腺素水平來治療抑郁癥，并通過阻斷通往腦的疼痛信號來治療神經病理性疼痛。該藥2004年8月3日獲美國食品藥品監(jiān)督管理局批準在美國上市以治療重癥抑郁，同年9月3日又被批準用于治療糖尿病性周圍神經疼痛(DPN)。目前已成為3-芳氧基-3-芳基丙胺類抗抑郁藥物的最優(yōu)秀的代表，每年的銷售額近達35億美元。(S)-氮，氮-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩)-l-丙胺((S)-DHTP)是合成度洛西汀重要手性中間體(見圖1)，具有重要的應用價值。?

4-氯-3-羥基丁酸乙酯中含有性質活潑的氯原子，使之在一些不對稱合成中得到廣泛應用，成為許多手性藥物的重要手性中間體。例如，通過不對稱還原，可以由4-氯-3-羥基丁酸乙酯得到(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，后者是合成Slagenins?B和C，以及HMG-CoA還原酶抑制劑的關鍵手性中間體，在醫(yī)藥工業(yè)中也具有重要的用途。?

制備(S)-氮，氮-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩)-l-丙胺和(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法主要包括化學合成法和生物合成法兩大類。化學合成度洛西汀中間體的方法主要是利用化學催化劑四氫鋁鋰(LiAlH₄)或硼化氫(BH₃)催化前手性酮化合物氮，氮-二甲基-3-氧代-3-(2-噻吩)-l-丙胺鹽酸鹽不對稱還原為氮，氮-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩)-l-丙胺，再利用化學拆分劑如(S)-扁桃酸拆分消旋體醇。化學合成S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法是以銠、釕等價格昂貴的金屬作為催化劑、以氫氣作為還原劑進行的。這些化學還原方?法不僅產率和產物光學純度低，而且還存在反應安全性差、成本高、副反應多以及環(huán)境污染嚴重等缺點。?

生物合成法是利用生物體內的羰基還原酶(Alcohol?dehydrogenase，ADH)作為催化劑，將潛手性酮化合物直接還原成手性醇。生物合成法包括酶催化和全細胞催化法兩大類，由于游離酶催化的氧化還原反應需要價格昂貴的輔酶(NADPH或者NADH)，而微生物細胞含有可以接受廣泛非天然底物的多種脫氫酶、必需的輔酶和再生途徑，只需加入少量廉價的共底物(如蔗糖或葡萄糖)，因此后者更加方便實用。?

細胞催化法制備手性藥物關鍵中間體的關鍵是要獲得高活力(羰基還原酶活力)的微生物菌株。但目前，利用野生菌株生物催化存在的一個問題是獲得羰基還原酶活力并不高，而且培養(yǎng)周期長。此外，由于野生菌體自身酶種類繁多，所獲的產物中常常還有菌體中其他酶類作用所產生的副產物，需要對產物進行復雜的分離純化才能得到合乎質量要求的產品，導致生產成本增加。?

發(fā)明內容

本發(fā)明提供了一種表達羰基還原酶的重組工程菌，以解決野生菌株羰基還原酶表達水平和表達酶活不足的問題。?

一種表達羰基還原酶的重組工程菌，包括宿主細胞和轉入宿主細胞的重組載體，所述重組載體由原始載體及插入原始載體的目的基因構成，所述宿主細胞為大腸桿菌(E.coli)Rosetta(DE3)，所述目的基因為羰基還原酶基因，堿基序列如SEQ?ID?NO.1所示。?

優(yōu)選的，所述原始載體為pET-28a(+)。?

本發(fā)明還提供了所述重組工程菌在生產手性藥物中間體中的應用，所述手性藥物中間體為(S)-氮，氮-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩)-l-丙胺或(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。?

具體包括以下步驟：?

(1)將所述重組工程菌接入培養(yǎng)基，誘導培養(yǎng)后收集菌體細胞；?

(2)將菌體細胞懸浮于pH6～7的緩沖液中，加入原料和共底物，反應完成后，分離純化得到度洛西汀中間體；?

所述培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基；誘導劑選用IPTG或乳糖，IPTG濃度為?0.1～1mmol/L，更優(yōu)選為0.3mmol/L，若誘導劑為乳糖，所述乳糖濃度為1.5～3.0/L，更優(yōu)選為2.0g/L；誘導培養(yǎng)的溫度為25～37℃，優(yōu)選為32℃；誘導培養(yǎng)的時間為10～15h。?

所述原料為氮，氮-二甲基-3-氧代-3-(2-噻吩)-l-丙胺或其鹽酸鹽、4-氯乙酰乙酸乙酯。?