[發明專利]一種利用RNAi技術培育抗多種病毒煙草的方法

有效

• 申請號: 201210440489.5
• 申請日: 2012-11-07
• 公開（公告）號: CN102943091A
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發明（設計）人: 楊軍;張俊祺;宋紀真;王燃;羅朝鵬;李鋒;魏春陽;曹培健;林福呈
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

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技術領域

本發明屬于植物植物基因工程技術領域，具體是一種利用RNAi技術培育抗多種病毒煙草的方法，主要是針對煙草黃瓜花葉病毒（Cucumber?mosaic?virus,?CMV）、煙草馬鈴薯Y病毒（Potato?Y?virus,?PVY）、煙草普通花葉病毒病（Tobacco?mosaic?virus,?TMV）和煙草馬鈴薯X病毒病（Potato?virus?X,?PVX）的RNA干涉載體構建方法、及其在煙草上應用。?

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背景技術

病毒病是煙草生產中不可忽視的病害，是造成煙草生產損失的重要原因。我國主要病毒病種類有TMV、CMV、PVY、PVX和煙草蝕紋病（Tobacco?etch?virus,?TEV）等。20世紀60年代以前，全國煙區都以TMV危害最重；70年代以后，在黃淮煙區尤其是山東的CMV危害迅速上升，1974-1977年以CMV為主及CMV與TMV復合侵染，連續3年大流行，而在南方煙區和北方煙區仍以TMV為主要病害；20世紀80年代以后，不僅CMV在中、南部煙區危害繼續上升，各類病毒病交替或同時流行危害，PVY開始發現，并逐年加重，已成為又一個主要病毒病害，與CMV、TMV混合發生、復合侵染。據統計，2008年我國病毒病造成的煙葉產值損失占病蟲害總損失的23.4%。病毒侵染煙草后造成的花葉、壞死等癥狀對煙葉質量產生重大損害。?

針對煙草病毒病發生的日趨嚴重，人們采用各種手段對其進行防治。然而，抗病品種的選育存在著培育時間長、容易出現抗性喪失等問題；農業措施往往只能減少或預防病毒初侵染源；化學藥劑方面，目前還沒有很好的方法能治療煙草病毒病，主要也是以防治病毒傳播介體為主要手段，化學農藥存在著防效低、在作物上的殘留多、對人畜有害及對環境造成污染等，目前用于防治病毒病害的農藥制劑雖多，但是真正的有效成分和劑型很有限；生物防治方面在生產上的真正應用還很少。各種實踐經驗以及研究表明，通過育種或抗病毒基因工程方法使植物體本身具備病毒抗性是防治病毒最為有效的方法。?

近年來，RNA干涉（RNA?interference，RNAi）技術在抗病毒研究中倍受關注，RNAi是一種基因沉默新技術，即人為地將與病毒基因同源的雙鏈RNA導入寄主，引起與其同源的病毒基因發生沉默，從而達到抑制病毒復制的目的。對動植物而言，RNA干擾是植物調控內源基因表達和防御外源核酸入侵的重要機制。?

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發明內容

本發明以我國四種主要煙草病毒（TMV、CMV、PVY和PVX）為對象，利用植物基因工程技術將人為構建的包含四種病毒序列的發夾狀結構轉入煙草中，使煙草轉錄出的發夾狀雙鏈RNA結構在植物自身機制下剪切成小RNA（siRNA），特異性地干擾、降解或沉默靶標病毒基因在煙草植株體內的正常復制和積累，篩選獲得抗多種煙草病毒的煙草新材料，為利用RNAi介導的煙草抗病毒煙草育種工作提供了經驗和實例。?

基于上述目的，本發明提供了一種可供農桿菌遺傳轉化煙草、針對多種煙草病毒的RNAi載體構建方法，該載體包含致病病毒CMV的RNA2-2B基因、PVY的HC-Pro基因、PVX的CP基因和TMV的CP基因部分保守核苷酸序列，以及利用該載體遺傳轉化煙草獲得抗病毒煙草。該技術方法的建立將為煙草抗病毒育種工作提供一種新的策略和思路。?

本發明目的是通過以下技術方案來實現的：?

一種利用RNAi技術培育抗多種病毒煙草的方法，通過對GenBank中4種病毒（CMV、PVY、PVX、TMV）的多條基因組全長序列進行比對，篩選到4種病毒在基因組范圍內的相對保守區域；最終選定各病毒序列，連接成800bp的嵌合基因；依此構建了嵌合基因的RNAi植物表達載體，通過農桿菌轉化普通煙草，獲得轉基因植株，經檢測得到轉化成功的植株。

具體步驟如下：?

1）嵌合基因的設計與合成

通過對GenBank中4種病毒（CMV、PVY、PVX、TMV）的多條基因組全長序列進行比對，篩選4種病毒基因組范圍內的多個相對保守區域，針對CMV的2B、PVY的HC-PRO、TMV和PVX的?CP基因（編碼外殼蛋白coat?protein）區域各篩選確定200bp片段。4段序列連接成總共800?bp的序列，排列順序為TMV-PVX-CMV-PVY，人工合成全長嵌合基因。

?2）RNAi載體構建

（1）內含子的選取