[發明專利]一種利用RNAi技術培育抗多種病毒煙草的方法

有效

• 申請號: 201210440489.5
• 申請日: 2012-11-07
• 公開（公告）號: CN102943091A
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發明（設計）人: 楊軍;張俊祺;宋紀真;王燃;羅朝鵬;李鋒;魏春陽;曹培健;林福呈
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

1.一種利用RNAi技術培育抗多種病毒煙草的方法，其特征在于：通過對GenBank中4種病毒CMV、PVY、PVX、TMV的多條基因組全長序列進行比對，篩選到4種病毒在基因組范圍內的相對保守區域；最終選定各病毒序列，連接成800bp的嵌合基因；依此構建了嵌合基因的RNAi植物表達載體，通過農桿菌轉化普通煙草，獲得轉基因植株，經檢測得到轉化成功的植株。

2.根據權利要求1所述的利用RNAi技術培育抗多種病毒煙草的方法，其特征在于：具體步驟如下：

1）嵌合基因的設計與合成

通過對GenBank中4種病毒CMV、PVY、PVX、TMV的多條基因組全長序列進行比對，篩選4種病毒基因組范圍內的多個相對保守區域，分別針對CMV的2B、PVY的HC-PRO、TMV和PVX的?CP基因區域各篩選確定200bp片段，4段序列連接成總共800?bp的序列，排列順序為TMV-PVX-CMV-PVY，人工合成全長嵌合基因；

2）RNAi載體構建

（1）內含子的選取

人工構建發夾結構表達載體，需要在反向重復序列中間插入內含子來穩定轉錄形成的發夾結構，本發明克隆在煙草細胞內普遍表達較為穩定的細胞色素P450基因的內含子，設計引物5p450和3p450擴增得到內含子，連接至克隆載體，用于RNAi載體構建；

（2）構建發夾結構

根據已有的克隆載體pBlueScript?KS?II和植物表達載體pBIN219中多克隆位點（MCS）情況，選擇引物上的酶切位點，同時避免涉及800?bp和內含子中包含的酶切位點，據此設計了含有不同酶切位點的引物用以擴增各個片段，引物序列見下表：

引物序列酶切位點5p450G TACATATCAC TTTAATTCA無3p450CTGA TTGTGCAATA CATATT無ihp1CG GGATCC GGTGTACAGG TACAATGCGGBamHIihp2CCG CTCGAG TCAAAAAGAA ATTATTCAGA AXhoIihp3ACGC GTCGAC TCAAAAAGAA ATTATTCAGA ASalIihp4GG GAGCTC GGTGTACAGG TACAATGCGGKpnIint1CCG CTCGAG G TACATATCAC TTTAATTCAXhoIint2ACGC GTCGAC CTGA TTGTGCAATA CATATTSalI

在用于擴增800bp嵌合基因的引物中引入BamH?I和EcoR?V、Xho?I和Kpn?I位點，用于擴增內含子的引物中引入EcoR?V和Xho?I位點，通過雙酶切，首先將正向800?bp連接至克隆載體，轉化大腸桿菌DH5α；通過菌落PCR及質粒酶切鑒定得到已插入目的片段的陽性克隆，內含子和反向800?bp以同樣的方式，將嵌合基因與內含子依次連接至克隆載體，構成載體pBS-ihp；

通過雙酶切能夠得到大小約為2000?bp、具有反向重復結構的DNA片段；經過測序證實所得片段確為目的發夾結構，且方向無誤，不存在突變位點；

（3）構建植物表達載體

為使發夾結構在植物細胞內具有較高的轉錄水平，本實驗選擇含有35S啟動子和nos終止子的pBIN219作為表達載體，pBIN219含有的35S啟動子能夠在植物細胞高水平轉錄，而NPTII基因使其具備卡那霉素篩選抗性，在NPTII基因和nos終止子兩端的邊界序列（LB和RB）能夠使農桿菌在侵染植物細胞時，將該序列之間的T-DNA整合至植物基因組；將上一步驟中獲得的2000?bp左右片段雙酶切從克隆載體上切下，連入pBIN219的多克隆酶切位點，轉化大腸桿菌DH5α，構建為pBIN-ihp；

3）抗病毒轉基因煙草的培育

將構建成功的表達載體pBIN-ihp利用凍融法直接導入農桿菌LBA4404，使用葉盤法轉化無菌苗煙草，經農桿菌浸泡的葉片于弱光下暗培養2天，然后轉入含有卡那霉素的MS分化篩選培養基中培養，每隔7天更換一次培養基以保證養分供應，約10天后在葉片邊緣開始有愈傷組織形成，一個月后，愈傷組織上分化出小芽，長至長約1cm，切下含有生長點的小芽至含有抗生素的生根培養基中誘導生根，根系發育完全后的植株經過溫室煉苗，洗凈培養基，移植土中待后續檢測；以轉化空載體pBIN219的植株為對照；

以CTAB法提取的轉化植株基因組DNA為模板，使用嵌合基因兩端引物ihp1/ihp2或者嵌合基因和內含子引物進行擴增，檢測到部分植株基因組中已整合入上述構建的發夾結構；通過設置非轉基因植株為空白對照，排除單引物擴增結果的干擾；另外，對擴增所得片段進行測序，確認結果的準確性，最終得到轉化成功的植株，轉化成功率85.7%。