[發明專利]一種觀察早期胚胎體內發育時空分布的組織切片的制備方法及應用

無效

• 申請號: 201210439713.9
• 申請日: 2012-11-07
• 公開（公告）號: CN102944456A
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發明（設計）人: 卿素珠;張為民;徐永平;楊媛媛;袁蘇雅;徐金霞;姬麗娜
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/30
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 汪人和

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種觀察早期胚胎體內發育時空分布的組織切片的制備方法及應用。

背景技術

近年來，作為哺乳動物模式生物的小鼠在開展的一系列胚胎工程研究如轉基因小鼠、基因敲除鼠、克隆小鼠及小鼠胚胎干細胞工程等已成為常用的研究動物，這些技術又均是建立在小鼠早期胚胎發育的觀察與操作基礎上的，因此熟悉并掌握其胚胎發育時程及形態結構變化就尤為重要。

有關小鼠早期胚發育時程研究常用的方法是運用體視顯微鏡觀察，也有運用大體解剖和顯微操作技術對超排小鼠受精后的早期胚胎發育時程進行觀察（李子義等，1999）。近年來，運用微分干涉相差顯微鏡可對小鼠體外受精形成的早期胚各階段進行系統觀察（逢麗麗等，2008）。由于小鼠屬于子宮內發育動物，胚胎體積較小且深埋于母體生殖道中不便于相關操作和觀察，因此單純的體視顯微鏡觀察或結合顯微操作技術并不能很好的反應胚胎在生殖道內的位置關系，而微分干涉相差顯微鏡因對顯微鏡操作技術較高要求很難在一般實驗室普及和推廣使用。

發明內容

本發明解決的問題在于提供一種觀察早期胚胎體內發育時空分布的組織切片的制備方法及應用，通過制作不同發育時期整胚組織切片并進行標本染色，可以保證生殖道內胚胎位置的相對固定，便于觀察胚胎細胞及生殖道形態位置關系和胚胎發育的連續性。

本發明是通過以下技術方案來實現：

一種觀察哺乳動物早期胚胎體內發育時空分布的組織切片的制備方法，包括以下步驟：

1）分別將含各時期哺乳動物胚的輸卵管和子宮組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中進行固定；

含各時期哺乳動物胚的輸卵管包括含受精卵、2-細胞胚、4-細胞胚和8-細胞胚的輸卵管；

含各時期哺乳動物胚的子宮組織包括含桑葚胚、早期囊胚和晚期囊胚的子宮組織；

2）將固定好的輸卵管和子宮組織用水沖洗后，分別經上行梯度乙醇脫水，然后經浸蠟、包埋、連續切片得到切片，再裱片于多聚賴氨酸處理的載玻片上，45～50℃溫箱烤片，備染；

3）烤好的切片分別以二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ脫蠟；然后進行下行梯度乙醇復水，并用蒸餾水浸泡；

4）將復水后的切片用蘇木素伊紅染色后用中性樹膠封片；

或對切片進行免疫熒光組織化學染色后用抗熒光淬滅封片劑封片。

所述的上行梯度乙醇脫水步驟為：50%乙醇脫水30s、70%乙醇脫水30s、80%乙醇脫水1min、90%乙醇脫水1min、95%乙醇脫水1min、無水乙醇Ⅰ和無水乙醇Ⅱ各脫水1min。

所述輸卵管浸蠟時間12～15min，子宮浸蠟時間25～30min；所述的蠟為熔點54～56℃的Leica鱗片狀切片石蠟。

所述下行梯度乙醇復水的步驟為：無水乙醇Ⅰ和無水乙醇Ⅱ各1min、95%乙醇1min、80%乙醇1min、70%乙醇30S。

所述步驟4）中對切片進行蘇木素伊紅染色后用中性樹膠封片的步驟為：蘇木精染液10min，體積濃度1%的鹽酸酒精分化20～40S，流動自來水藍化15min，伊紅醇溶液染色1.5min，自來水速洗1次，乙醇脫水；二甲苯Ⅰ透明5min，二甲苯Ⅱ透明5min；中性樹膠封片。

所述步驟4）中對切片進行免疫熒光組織化學染色后用抗熒光淬滅封片劑封片的步驟為：切片用0.1%Triton?X-100處理3min，洗滌5min×3；封閉液4h，洗滌5min×3；一抗1:100，4℃過夜，PBS?5min×5；二抗1:50，2h，PBS?5min×5；DAPI染核5min，PBS?5min×5；抗熒光淬滅封片劑封片。

所述將蘇木素伊紅染色后用中性樹膠封片所所制備的組織切片在光鏡下觀察、記錄，然后用數碼顯微鏡拍照，對各時期鼠胚形態及在生殖道內位置關系依據時間次序排列，形成涵蓋受精卵、2-細胞胚、4-細胞胚、8-細胞胚、桑葚胚及囊胚在生殖道內時空分布的發育圖譜。

所述將進行免疫熒光組織化學染色后用抗熒光淬滅封片劑封片所得的組織切片，與不加一抗的空白對照組進行對照，DMIRB型熒光相差倒置顯微鏡照相，得到一抗針對的抗原在小鼠體內發育各時期胚胎中表達的圖譜。

具體的，針對小鼠早期胚胎體內發育時空分布的組織切片，在免疫熒光組織化學染色時，采用的一抗為羊抗鼠Crb3，二抗為FITC標記的兔抗羊IgG；得到Crb3在小鼠體內發育各時期胚胎中表達的圖譜。

所述的觀察哺乳動物早期胚胎體內發育時空分布的組織切片的制備方法在制作小鼠早期胚胎發育圖譜中的應用。