[發明專利]一種觀察早期胚胎體內發育時空分布的組織切片的制備方法及應用

無效

• 申請號: 201210439713.9
• 申請日: 2012-11-07
• 公開（公告）號: CN102944456A
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發明（設計）人: 卿素珠;張為民;徐永平;楊媛媛;袁蘇雅;徐金霞;姬麗娜
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/30
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 汪人和

1.一種觀察哺乳動物早期胚胎體內發育時空分布的組織切片的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）分別將含各時期哺乳動物胚的輸卵管和子宮組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中進行固定；

含各時期哺乳動物胚的輸卵管包括含受精卵、2-細胞胚、4-細胞胚和8-細胞胚的輸卵管；

含各時期哺乳動物胚的子宮組織包括含桑葚胚、早期囊胚和晚期囊胚的子宮組織；

2）將固定好的輸卵管和子宮組織用水沖洗后，分別經上行梯度乙醇脫水，然后經浸蠟、包埋、連續切片得到切片，再裱片于多聚賴氨酸處理的載玻片上，45～50℃溫箱烤片，備染；

3）烤好的切片分別以二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ脫蠟；然后進行下行梯度乙醇復水，并用蒸餾水浸泡；

4）將復水后的切片用蘇木素伊紅染色后用中性樹膠封片；

或對切片進行免疫熒光組織化學染色后用抗熒光淬滅封片劑封片。

2.根據權利要求1所述的觀察哺乳動物早期胚胎體內發育時空分布的組織切片的制備方法，其特征在于，所述的上行梯度乙醇脫水步驟為：50%乙醇脫水30s、70%乙醇脫水30s、80%乙醇脫水1min、90%乙醇脫水1min、95%乙醇脫水1min、無水乙醇Ⅰ和無水乙醇Ⅱ各脫水1min。

3.根據權利要求1所述的觀察哺乳動物早期胚胎體內發育時空分布的組織切片的制備方法，其特征在于，所述輸卵管浸蠟時間12～15min，子宮浸蠟時間25～30min；所述的蠟為熔點54～56℃的Leica鱗片狀切片石蠟。

4.根據權利要求1所述的觀察哺乳動物早期胚胎體內發育時空分布的組織切片的制備方法，其特征在于，所述下行梯度乙醇復水的步驟為：無水乙醇Ⅰ和無水乙醇Ⅱ各1min、95%乙醇1min、80%乙醇1min、70%乙醇30S。

5.根據權利要求1所述的觀察哺乳動物早期胚胎體內發育時空分布的組織切片的制備方法，其特征在于，所述步驟4）中對切片進行蘇木素伊紅染色后用中性樹膠封片的步驟為：蘇木精染液10min，體積濃度1%的鹽酸酒精分化20～40s，流動自來水藍化15min，伊紅醇溶液染色1.5min，自來水速洗1次，乙醇脫水；二甲苯Ⅰ透明5min，二甲苯Ⅱ透明5min；中性樹膠封片。

6.根據權利要求1所述的觀察哺乳動物早期胚胎體內發育時空分布的組織切片的制備方法，其特征在于，所述步驟4）中對切片進行免疫熒光組織化學染色后用抗熒光淬滅封片劑封片的步驟為：切片用0.1%Triton?X-100處理3min，洗滌5min×3；封閉液4h，洗滌5min×3；一抗1:100，4℃過夜，PBS?5min×5；二抗1:50，2h，PBS?5min×5；DAPI染核5min，PBS?5min×5；抗熒光淬滅封片劑封片。

7.根據權利要求1所述的觀察哺乳動物早期胚胎體內發育時空分布的組織切片的制備方法，其特征在于，將蘇木素伊紅染色后用中性樹膠封片所所制備的組織切片在光鏡下觀察、記錄，然后用數碼顯微鏡拍照，對各時期鼠胚形態及在生殖道內位置關系依據時間次序排列，形成涵蓋受精卵、2-細胞胚、4-細胞胚、8-細胞胚、桑葚胚及囊胚在生殖道內時空分布的發育圖譜。

8.根據權利要求1所述的觀察哺乳動物早期胚胎體內發育時空分布的組織切片的制備方法，其特征在于，將進行免疫熒光組織化學染色后用抗熒光淬滅封片劑封片所得的組織切片，與不加一抗的空白對照組進行對照，DMIRB型熒光相差倒置顯微鏡照相，得到一抗針對的抗原在小鼠體內發育各時期胚胎中表達的圖譜。

9.根據權利要求1所述的觀察哺乳動物早期胚胎體內發育時空分布的組織切片的制備方法，其特征在于，針對小鼠早期胚胎體內發育時空分布的組織切片，在免疫熒光組織化學染色時，采用的一抗為羊抗鼠Crb3，二抗為FITC標記的兔抗羊IgG；得到Crb3在小鼠體內發育各時期胚胎中表達的圖譜。

10.權利要求1所述的觀察哺乳動物早期胚胎體內發育時空分布的組織切片的制備方法在制作小鼠早期胚胎發育圖譜中的應用。