[發(fā)明專(zhuān)利]一種具有免疫活性的多肽衍生物及其內(nèi)參抗體的制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210438803.6
• 申請(qǐng)日: 2012-11-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102993276A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姬志娟;鄔曉樂(lè);鄔江;張波;張軍龍;張春玲;張婉婷;薛金蓮;沈向陽(yáng);喬國(guó)明
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 北京博奧森生物技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/00
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/00;C07K1/20;C07K1/06;C07K1/04;C07K16/00
• 代理公司: 北京市商泰律師事務(wù)所 11255
• 代理人: 毛燕生

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及化學(xué)合成技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種具有免疫活性的多肽衍生物及其內(nèi)參抗體的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前，常用的多肽化合物沒(méi)有完整的免疫原性，免疫時(shí)需要偶聯(lián)載體蛋白，并且特異性不強(qiáng)，靈敏度不高，制備方法復(fù)雜。更重要的是由于制備后的抗原含有載體蛋白，所以用此抗原制備的抗體會(huì)產(chǎn)生抗載體蛋白的抗體，有時(shí)會(huì)對(duì)后期的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生不良影響即非特異性反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少解決上述技術(shù)問(wèn)題之一。

為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種具有完整免疫原性，且制備方法簡(jiǎn)單的具有免疫活性的多肽衍生物。

根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的具有免疫活性的多肽衍生物，具有下列序列結(jié)構(gòu)：R₈(Kys)₄-(Lys)₂-Lys-Gly，其中，R表示多肽片段，其序列為：YDESGPSIVHRKCF-GSK。

根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的具有免疫活性的多肽衍生物，一個(gè)賴(lài)氨酸支架上同時(shí)合成八個(gè)目的多肽，該目的多肽大大的增加了多肽抗原的分子量及抗原性，從而免去偶聯(lián)載體蛋白，使抗原的特異性更好。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提出一種具有免疫活性的多肽衍生物及其內(nèi)參抗體的制備方法，其具體操作步驟可以包括：

a）提供9-芴基甲氧羰?；Ｗo(hù)的氨基酸（Fmoc-AA）并使其活化，得到活化氨基酸；

b）將所述活化氨基酸與P-羥甲基苯氧甲基多聚乙烯樹(shù)脂（HMP樹(shù)脂）反應(yīng)，得到連接有氨基酸的樹(shù)脂；

c）脫除所述連接有氨基酸的樹(shù)脂的Fmoc保護(hù)基；

d）將脫除Fmoc保護(hù)基的連接有氨基酸的樹(shù)脂與過(guò)量的活化羧基組份偶聯(lián)，并脫去偶聯(lián)后活化氨基組份的氨基保護(hù)基；

e）重復(fù)步驟d）至脫去偶聯(lián)后活化氨基組份的氨基保護(hù)基的數(shù)目為8，得到八分支活化氨基組份骨架；

f）將所述八分支活化氨基組份骨架同時(shí)連接8個(gè)相同的多肽，得到肽樹(shù)脂，將所述肽樹(shù)脂分離提純，得到具有免疫活性的多肽衍生物。

根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的具有免疫活性的多肽衍生物及其內(nèi)參抗體的制備方法，其合成過(guò)程在自動(dòng)化的多肽合成儀上完成，制備工藝簡(jiǎn)便，結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確，偶聯(lián)率高，周期短，自動(dòng)化程度高。

為了快速得到八分支活化氨基組份骨架，所述活化氨基組份優(yōu)選為賴(lài)氨酸。當(dāng)所述活化氨基組份為賴(lài)氨酸時(shí)，在脫去偶聯(lián)后活化氨基組份的氨基保護(hù)基過(guò)程中便可脫去兩個(gè)氨基保護(hù)基，再與過(guò)量的賴(lài)氨酸偶聯(lián)時(shí)，就可以與兩個(gè)賴(lài)氨酸同時(shí)偶聯(lián)，再脫去偶聯(lián)后活化氨基組份的氨基保護(hù)基時(shí)便可脫去四個(gè)氨基保護(hù)基。依此類(lèi)推，第三次脫除過(guò)程便可脫去八個(gè)氨基保護(hù)基，得到八分支活化氨基組份骨架。

所述八個(gè)相同的多肽R優(yōu)選為YDESGPSIVHRKCF-GSK，由此，便可得到具有免疫活性的多肽衍生物(YDESGPSIVHRKCF-GSK)₈(Kys)₄-(Lys)₂-Lys-Gly。

關(guān)于具有免疫活性的多肽衍生物的分離提純，具體可以包括：

f-1）用三氟乙酸(TFA)結(jié)合清除劑與所述肽樹(shù)脂反應(yīng)，以將所述具有免疫活性的多肽衍生物從肽樹(shù)脂上分離；

f-2）反應(yīng)后去除清除劑，并用萃取液萃取，得到具有免疫活性的多肽衍生物粗品；

f-3）將具有免疫活性的多肽衍生物粗品進(jìn)行純化，得到具有免疫活性的多肽衍生物。

關(guān)于清除劑的選擇，沒(méi)有特殊限制，只要能將所述具有免疫活性的多肽衍生物從肽樹(shù)脂上分離即可，優(yōu)選地，所述清除劑為1，2-乙二硫醇（EDT）、硫代苯甲醚和水的混合溶液。為了保證反應(yīng)的充分進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選3h。

所述萃取液的選擇也沒(méi)有特殊限制，考慮到成本問(wèn)題，所述萃取液優(yōu)選為乙醚。

關(guān)于具有免疫活性的多肽衍生物的純化，采用高效液相色譜分離純化，其具體操作條件為：

由此，可制得純度為98%以上的具有免疫活性的多肽衍生物。

本發(fā)明還提出了一種具有免疫活性的多肽衍生物在制備抗體中的應(yīng)用。

基于所述具有免疫活性的多肽衍生物具有完整的免疫原性，則根據(jù)該具有免疫活性的多肽衍生物制備而成的抗體具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，為廣大科研人員提供了高質(zhì)量的抗體，同時(shí)為開(kāi)發(fā)其它多肽抗體開(kāi)辟了一條新思路。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

附圖說(shuō)明