[發明專利]一種八寶景天基因組DNA的提取方法

無效

• 申請號: 201210438729.8
• 申請日: 2012-11-07
• 公開（公告）號: CN102876665A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 周祥明;宋建;王姝
• 申請（專利權）人: 天津市農業生物技術研究中心
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

技術領域

本發明涉及分子生物學實驗中植物基因組DNA的分離提取技術，具體涉及一種八寶景天基因組DNA的提取方法。

背景技術

八寶景天（Sedum?spectabile）是景天科景天屬肉質草本植物，性喜強光，耐貧瘠和干旱，也能耐－25℃的低溫，管理粗放，病蟲害少，是一種不可多得的優良園林綠化材料。作為景觀工程，八寶景天的群體綠化效果極佳，也是很好的模紋材料。同時可以全草入藥，具有祛風利濕，活血散瘀，止血止痛的功效。八寶景天中含有豐富的多糖和其他次生代謝產物，這讓它具有了較高的利用價值，但同時給其基因組DNA的提取也帶來了較大的困難。由于多糖的某些物理性質與核酸極為相似，在沉淀DNA過程中，多糖與DNA發生共沉淀而難以分離，因而影響了所提取的DNA質量，使得無法以DNA為模板進行后續的實驗研究。

基因組DNA的提取是分子生物學研究中的關鍵環節之一。所提取的基因組DNA的質量和產量將直接影響分子生物實驗中與DNA有關的下游實驗。目前，已報道了多種植物DNA提取方法，筆者通過研究發現，多數DNA提取方法并不適用于景天植物的DNA提取如常規CTAB法和SDS法，這些提取方法僅對含有極少量多糖、多酚等植物有效，而對于多糖、多酚等含量高的植物基本無效。有些方法雖然能夠獲得基因組DNA，但所提取的基因組DNA質量不高，而且整個操作復雜。筆者在前人研究的基礎上，經過大量的研究實驗，在常規CTAB提取方法的基礎上，經過改良獲得了一種高效提取景天植物基因組DNA的方法。此方法在操作步驟上與常規CTAB基本相同，但在提取液方面添加了可溶性PVP和SDS，另外，加大了β-巰基乙醇量，使得所提取的景天基因組DNA質量大大提高，可用于后續實驗研究。

發明內容

本發明的目的在于針對八寶景天富含多糖、多酚、多蛋白及自身組織的特點，提出了一種八寶景天基因組DNA提取方法。為實現此目的本發明公開了如下的技術內容：

一種八寶景天基因組DNA的提取方法，其特征在于按以下的步驟進行：

(1)取0.2g新鮮葉片放入研缽中，加入0.02g-0.04g石英砂，用液氮充分研磨成粉末，加入預熱的0.5mL?2％CTAB提取液溶解；

所述的2％CTAB混合提取液是由下述原料組成：

2％CTAB??????????????????????2g/100mL

2%SDS???????????????????????2g/100mL

2%PVP、?????????????????????2g/100mL

pH值為8.0的0.1mol/LTris-Cl????1.1214g/100mL

20mmol/LEDTA????????????????0.744g/100mL

1.4mol/LNaCl??????????????????8.19g/100mL

10％的β-巰基乙醇?????????????10ml/100mL。

(2)在55℃～65℃下溫浴45分鐘，取出冷卻后再加入0.5-1mL氯仿-異戊醇混合液，常溫下12000-15000轉/分，離心10-15分鐘；其中氯仿與異戊醇的體積比為24∶1；?

(3)取上清液轉入新離心管，再加入等體積的氯仿-異戊醇混合液（其中氯仿與異戊醇的體積比為24∶1），常溫下12000-15000轉/分，離心10-15分鐘；?

(4)取上清液再轉入新離心管，并加入上清液2/3體積的冰冷異丙醇混合，-20℃條件下放置15-30分鐘沉淀DNA；?

(5)8-10℃，12000-15000轉/分，離心10-15分鐘，棄上清液，回收沉淀，用70％乙醇洗滌2次，風干后加入pH值為8.0的TE緩沖液80-100μl；然后加入5-8μL?RNase，37℃保溫1-1.5小時，置于-20℃條件下保存；所述的TE緩沖液包括：10mmol/L?pH=8.0的Tris-Cl和1mmol/L的EDTA。

本發明所述的提取方法，其中步驟(5)所使用的RNase，儲藏濃度為10mg/mL，終濃度為0.5mg/mL。

上述步驟（1）所使用的2％CTAB提取液包括：2％CTAB、2％SDS、2%PVP、0.1mol/LTris-HCl（pH=8.0）、20mmol/L的EDTA、1.4mol/L的NaCl以及10％的β-巰基乙醇。