[發明專利]用于鑒定小麥春化基因VRN-A1和VRN-B1的PCR體系

無效

• 申請號: 201210436945.9
• 申請日: 2012-11-05
• 公開（公告）號: CN102925571A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 穆培源;張曉科;相吉山;張影全;桑偉;徐紅軍;韓新年;聶迎彬;崔鳳娟;鄒波
• 申請（專利權）人: 新疆農墾科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;A01H1/04;A01H1/02
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種用于鑒定或輔助鑒定小麥春化基因VRN-A1和VRN-B1的PCR體系及其應用，特別涉及一種用于鑒定或輔助鑒定小麥春化基因VRN-A1和VRN-B1的多重PCR引物對組、試劑盒及其應用。

背景技術

春化階段是小麥生長發育的基本階段之一。小麥的春化反應與其生育期及適應性密切相關，是指導小麥區劃和新品種推廣的主要依據之一，受春化基因控制。春化基因決定小麥全生育周期長短的70~75%。Iwaki和Van?Beem等研究表明，世界不同地區小麥品種的春化基因組成存在差異，反映了不同生態類型對品種春化反應的要求不同。

春化基因VRN-1編碼的蛋白為MADS-box轉錄因子，受低溫誘導促進開花，是普通小麥春化作用的一類主要基因，包括3個位點VRN-A1、VRN-B1和VRN-D1，分別位于5A、5B和5D染色體長臂上。3個基因位點不同的等位變異對春化作用的效應不同，顯性等位變異Vm-A1的效應最強，表現為對春化作用高度不敏感，同時對Vrn-B1和Vrn-D1位點基因具有上位性效應；顯性等位變異Vrn-B1和Vrn-D1對春化作用的敏感性較弱，兩者之間未發現彼此間的上位作用。Yan和Fu等發現，VRN-1春化基因變異類型受其啟動子區和第一個內含子區決定。在普通小麥中，VRN-A1位點有4種變異類型，分別為Vrn-A1a、Vrn-A1b、Vrn-A1c和vrn-A1，其中Vrn-A1a、Vrn-A1b和Vrn-A1c表現為顯性，vrn-A1為隱性；VRN-B1和VRN-D1位點一般通常存在兩種等位變異類型，即顯性和隱性等位變異。與隱性等位變異類型相比，顯性等位變異Vrn-A1a和Vrn-A1b分別在啟動子區域插入和缺失了一定數量的堿基序列，而顯性Vrn-A1c、Vrn-B1和Vrn-D1在第一個內含子序列出現了大片段堿基的缺失。

在普通小麥中，VRN-A1位點存在4種等位變異，需要用3對引物分別進行3次PCR檢測；VRN-B1和VRN-D1位點兩種等位變異，需要用兩對引物分別進行兩次PCR檢測。為此，檢測1個小麥材料春化基因VRN-1的3個位點等位變異組成，需要連續進行7次PCR檢測，檢測程序繁瑣，實驗成本高。

多重PCR這一概念自1988年由Chambercian等提出后，由于其快速、高效、低成本等一系列的優點，使得這項技術在生命科學領域得到了廣泛的應用，如植物種質純度鑒定、植物分子育種、植物病蟲害檢測等。利用多重PCR技術，在同一個PCR反應體系中加入兩對或兩對以上特異性引物進行擴增，可以同時檢測出多個等位變異類型，降低檢測成本，提高效益。

發明內容

本發明的目的是提供用于鑒定或輔助鑒定待測小麥春化基因的多重PCR引物對組、試劑盒，以及利用所述多重PCR引物對組鑒定或輔助鑒定待測小麥春化基因的方法。

本發明所提供的用于鑒定或輔助鑒定待測小麥春化基因的多重PCR引物對組，由引物對組A和引物對組B組成；所述引物對組A由特異于所述VRN-A1基因的兩個引物對組成；所述引物對組B由特異于所述VRN-B1基因的兩個引物對組成；

所述引物對組A中，所述特異于VRN-A1基因的兩個引物對分別為序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對1，以及序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2；

所述引物對組B中，所述特異于VRN-B1基因的兩個引物對分別為序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對3，以及序列5和序列7所示的兩條單鏈DNA組成的引物對4。

其中，序列1由20個核苷酸組成；序列2由20個核苷酸組成；序列3由20個核苷酸組成；序列4由20個核苷酸組成；序列5由20個核苷酸組成；序列6由23個核苷酸組成；序列7由22個核苷酸組成。

本發明中，所述VRN-A1基因有四個等位基因，分別是Vrn-A1a、Vrn-A1b、Vrn-A1c和vrn-A1（前三個表現為顯性，最后一個表現為隱性）；所述VRN-B1基因有兩個等位基因，分別是Vrn-B1和vrn-B1（前一個表現為顯性，后一個表現為隱性）。

所述引物對組A中，所述序列1、所述序列2、所述序列3和所述序列4共四條單鏈DNA在PCR反應體系中的摩爾比為1~1.5：1~1.5：1~1.5：1~1.5；所述引物對組B中，所述序列5、所述序列6和所述序列7共三條單鏈DNA在PCR反應體系中的摩爾比為2~2.5：1~1.5：2~2.5。