[發(fā)明專利]一種粘桿菌素菌種篩選方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210436791.3
• 申請日: 2012-11-06
• 公開（公告）號: CN103060227A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設計）人: 李琪;劉聰潔;王繪磚
• 申請（專利權）人: 河北圣雪大成制藥有限責任公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/04;C12R1/07
• 代理公司: 石家莊國域專利商標事務所有限公司 13112
• 代理人: 白海靜

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體地說涉及粘桿菌素菌種篩選方法。

背景技術

粘桿菌素（Colistin）國內(nèi)又稱粘菌素、抗敵素、克利斯汀，是1947年由美國和英國的學者在多粘芽孢桿菌（Bacillus?polymyxa）培養(yǎng)液中與多粘菌素B（Polymyxin?B）一起發(fā)現(xiàn)的，當時被稱為多粘菌素E（Polymyxin?E）。后來由粘桿菌素芽孢桿菌（Bacillus?colistinus）發(fā)酵生產(chǎn)，改稱為粘桿菌素。它是一種帶有氨基酸環(huán)和脂肪酸側鏈的堿性環(huán)肽類抗生素，能與細菌細胞膜上的脂類結合而擾亂細胞膜功能，并能破壞細胞壁的完整性，對革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌、流感桿菌、百日咳桿菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌特別是綠膿桿菌有很強的殺菌作用，且不易產(chǎn)生抗藥性。

多粘菌素菌種篩選是提高、穩(wěn)定菌種質(zhì)量的關鍵環(huán)節(jié)。一直以來，多粘菌素高產(chǎn)菌株篩選采用自然分離、紫外誘變等隨機性較強的方法。這些方法篩選效率低，周期長。另外，菌株產(chǎn)能測定多采用高壓液相色譜儀。由于菌株篩選經(jīng)過初篩和復試兩個階段，每批需測樣品均在150-180個以上，且發(fā)酵樣品檢測處理繁瑣，工作量大，液相色譜檢測所需時間較長，不僅降低了篩選效率，還影響高產(chǎn)菌株保存的最佳時期，對菌種活性造成一定損傷。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種篩選效率高，周期短，檢測方便的粘桿菌素菌種篩選方法。

本發(fā)明提供的粘桿菌素菌種篩選方法，包括將多粘芽孢桿菌（Bacillus?colistinus）加到含有L-天門冬氨酸的固體培養(yǎng)基中，單菌落成熟后傳斜面保存，同時接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)成熟后離心，取上清加入指示菌菌液中培養(yǎng)，制成被檢測樣品，檢測被檢測樣品的吸光度，選擇吸光度低的菌株保藏留用。

本發(fā)明更為具體的多粘菌素菌種篩選方法，包括以下步驟：

a、固體培養(yǎng)：將多粘芽孢桿菌稀釋至10^-3-10^-6個/mL，取0.2?mL涂布到含有0.2mg/mL的L-天門冬氨酸的固體培養(yǎng)基中，于28℃-37℃，40%-60%濕度條件下培養(yǎng)72-100?h；所述固體培養(yǎng)基由0.2mg/mL?L-天門冬氨酸、1%-3%葡萄糖、1%-3%酵母膏、0.1%-0.5%蛋白胨、0.1%-0.5%氯化鈉、2.2%瓊脂、余量為水的組分組成，pH6.0-7.0；

b、斜面培養(yǎng)：在含有L-天門冬氨酸的固體培養(yǎng)基上挑取外形規(guī)則的單菌落，劃線涂布于斜面培養(yǎng)基上，于28℃-37℃，40%-60%濕度條件下培養(yǎng)72-100?h；所述斜面培養(yǎng)基的成分與a步驟中的固體培養(yǎng)基成分相同；

c、發(fā)酵培養(yǎng)：將斜面培養(yǎng)基上成熟的斜面菌苔用接種針轉接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃-37℃，200?rpm條件下震蕩培養(yǎng)72-96?h，離心，得發(fā)酵上清液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基由3-5%豆粕粉、1-3%硫酸銨、0.05-0.10%磷酸二氫鉀、0.01-0.07%七水硫酸亞鐵、余量為水組分組成，pH6.0-7.0；

d、制備指示菌菌液：取-80℃保存的大腸桿菌于37℃-38℃水浴快速化凍，按照2%-3%的接種量接種于LB培養(yǎng)基中；所述LB培養(yǎng)基由0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨，1%氯化鈉組成，pH7.0-7.2；

e、制備被檢測樣品：取c步所制發(fā)酵上清液30-50?μL加入250-270?μL?d步所制指示菌菌液中，于37℃，200?rpm條件下用?96孔板震蕩培養(yǎng)2-3?h；

f、高產(chǎn)菌株篩選：取被檢測樣品200?μL至96孔酶標板中，采用酶標儀進行吸光度檢測，選擇吸光值最低的菌株進行保藏留用。

本發(fā)明方法，在于所采用的酶標儀，其濾光片波長優(yōu)選條件是設置在660?nm進行吸光度檢測。

本發(fā)明是以大腸桿菌為指示菌，向含有大腸桿菌的指示菌菌液中加入經(jīng)培養(yǎng)的多粘菌素菌株，再培養(yǎng)一定時間后，測定培養(yǎng)液的吸光度；吸光度越低，意味著培養(yǎng)液中大腸桿菌受到的抑制作用越強。經(jīng)測定表明，大腸桿菌受到的抑制作用強弱與粘桿菌素效價高低成正比，因此，可據(jù)此挑選出粘桿菌素高產(chǎn)菌株。

本發(fā)明的方法大大提高了多粘菌素菌種篩選速度；將篩選周期由原來的3-4周縮短到1周，篩選效率提高了70%以上。

附圖說明