[發(fā)明專利]SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測類豬圓環(huán)病毒P1的引物

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210436587.1
• 申請日: 2012-11-06
• 公開（公告）號: CN102888471A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發(fā)明（設計）人: 溫立斌;何孔旺;高曉靜;王小敏;李彬;郭容利;俞正玉;茅愛華;倪艷秀;張雪寒;呂立新;周俊明;胡屹屹;汪偉;葉青;祝昊丹;于洋;沈江萍;周萍
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業(yè)科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

技術領域

本發(fā)明涉及一種類豬圓環(huán)病毒P1(即是類豬圓環(huán)病毒2型因子P1，見溫立斌等，一株類豬圓環(huán)病毒2型因子P1的全基因組序列測定與分析，中國農業(yè)科學，2010年02期，411~416)的SYBR?Green?I實時熒光定量PCR檢測引物，屬于分子生物學領域。

背景技術

豬圓環(huán)病毒（porcine?circovirus,?PCV）屬于圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬，為單股環(huán)狀DNA病毒，是迄今發(fā)現的一種最小的動物病毒?，F已知PCV有兩個血清型，即PCV1和PCV2。PCV1為非致病性的病毒。PCV2為致病性的病毒，可引起圓環(huán)病毒相關疾病，其中最重要的是豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning?Multisystemic?Wasting?Syndrome，PMWS）。本病最早發(fā)現于加拿大（1991），很快在歐美及亞洲一些國家包括我國發(fā)生和流行，除PMWS外，PDNS（豬皮炎與腎病綜合征）、PNP（增生性壞死性肺炎）、PRDC（豬呼吸道疾病綜合征）、繁殖障礙、腸炎等疾病亦與PCV2感染有重要關聯。此外，PCV2感染可導致機體免疫抑制，引起免疫失敗以及繼發(fā)感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經濟損失?，F已被世界各國的獸醫(yī)與養(yǎng)豬業(yè)者公認為引起豬免疫障礙的重要傳染病(Segale′s等?Porcine?circovirus?diseases?.?Anim?Health?Res?Rev,?2005,?6:?119–142)。

????類豬圓環(huán)病毒P1是新近發(fā)現的病毒，可引起感染豬出現類似PMWS癥狀（Wen?等?A?novel?porcine?circovirus-like?agent?P1?is?associated?with?wasting?syndromes?in?pigs.?PLoS?ONE?2012,?7(8):?e41565）。它不僅擁有單股環(huán)狀DNA基因組，而且其核苷酸序列大部分與PCV2的高度同源（Wen?等?Complete?genome?sequence?of?a?novel?porcine?circovirus-like?agent.?J?Virol.?2012,?86(1):?639）。SYBR?Green?I是一種雙鏈DNA結合染料，其特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。與其他實時熒光定量PCR技術相比，SYBR?Green?I在核酸的實時檢測方法有很多優(yōu)點，由于它與所有的雙鏈DNA相結合，不必因為模板不同而特別定制，而且通過融解曲線分析可以識別擴增產物和引物二聚體，區(qū)分非特異性擴增。由于P1擁有與PCV2高度同源的序列，目前報道的診斷P1的定量PCR方法尚無法鑒別P1和PCV2，只能結合普通PCR結果綜合判斷(溫立斌等SYBR?Green?Ⅰ熒光定量PCR檢測類豬圓環(huán)病毒因子P1.華北農學報.2009，4：31-35)。本發(fā)明利用反向PCR原理，設計新型特異性引物，采用的絕對定量技術，為樣本中類豬圓環(huán)病毒P1載量消長規(guī)律等方面的研究提供方法，為P1流行病學監(jiān)測、致病機理的研究提供技術支持。同時還可區(qū)分P1與PCV2的感染提供技術平臺。

發(fā)明內容

技術問題

本發(fā)明的目的是克服現有技術中存在的上述不足，提供一種類豬圓環(huán)病毒P1的熒光定量PCR檢測引物和方法。該方法的檢測靈敏度可達10¹個拷貝的病毒分子，具有良好的特異性和重復性。不僅可對P1進行定量，還可對PCV2定性加以鑒別，從而為類豬圓環(huán)病毒P1的檢測和監(jiān)控提供有效方法。

技術方案

一種類豬圓環(huán)病毒P1的SYBR?Green?I實時熒光定量PCR檢測引物，其特征在于，

上游引物：?5'?AAGACCCCCCACTTAAACCC?3'?；

下游引物：?5'?GAGAGGCGGGTGTTGAAGAT?3'

其目的擴增片段為119?bp，擴增序列具體如下：?????AAGACCCCCCACTTAAACCCTAAATGAGGATCCACTAGTAACGGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGCTACCGTTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTC。

所述的引物用于類豬圓環(huán)病毒P1的SYBR?Green?I實時熒光定量PCR檢測方法為：?

（1）定量標準質粒的構建與制備