[發(fā)明專利]SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測類豬圓環(huán)病毒P1的引物

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210436587.1
• 申請日: 2012-11-06
• 公開（公告）號: CN102888471A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 溫立斌;何孔旺;高曉靜;王小敏;李彬;郭容利;俞正玉;茅愛華;倪艷秀;張雪寒;呂立新;周俊明;胡屹屹;汪偉;葉青;祝昊丹;于洋;沈江萍;周萍
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

1.一種類豬圓環(huán)病毒P1的SYBR?Green?I實時熒光定量PCR檢測引物，其特征在于，

上游引物：?5'?AAGACCCCCCACTTAAACCC?3'?；

下游引物：?5'?GAGAGGCGGGTGTTGAAGAT?3'

其目的擴增片段為119?bp。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物，其用于類豬圓環(huán)病毒P1的SYBR?Green?I實時熒光定量PCR檢測方法為：

（1）定量標準質(zhì)粒的構(gòu)建與制備

以提取的類豬圓環(huán)病毒P1?DNA為模板，用上游引物和下游引物進行PCR擴增含有靶序列的基因片段，PCR反應(yīng)體系為?2×PCR?TaqMix?12.5μL、50μmol/L權(quán)利要求1所述的上游引物0.25μL、50μmol/L的下游引物0.25μL、DNA模板2.5μL、無菌雙蒸水9.5μL，總反應(yīng)體系為25μL；

反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變形30s,56℃退火30s,72℃延伸30s，35個循環(huán)，72℃延伸10?min；

PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物于質(zhì)量比2%瓊脂糖凝膠中進行電泳；

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后，通過膠回收純化目的片段，然后將權(quán)利要求1所述的目的片段119?bp與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，進行測序鑒定，重組質(zhì)粒用質(zhì)粒小提試劑盒進行提純，獲得定量標準質(zhì)粒；

（2）抽提樣品病毒DNA，與標準質(zhì)粒按照以下定量PCR反應(yīng)體系和程序進行擴增：

PCR反應(yīng)體系為：12.5μL??2×UltraSYBR?Mix,?10μM正向引物、反向引物各0.025μL，待測樣品的DNA?2μL，補充雙蒸水至25μL；

PCR反應(yīng)程序為：95℃?10min;?95℃?15?sec,?60℃?30?sec,進行40個循環(huán)；

待測樣品的結(jié)果判定：當(dāng)待測樣品實時熒光定量PCR檢測結(jié)果有“S”型擴增曲線，Ct值≤34.0且?Tm值介于82.0℃——83.0℃之間時，判定待測樣品中含有類豬圓環(huán)病毒P1。