[發(fā)明專(zhuān)利]汗腺樣細(xì)胞凍存復(fù)蘇液及保持細(xì)胞活性的凍存復(fù)蘇方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210436501.5
• 申請(qǐng)日: 2012-11-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103798224A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-05-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 付小兵;馬奎;黃沙;盛志勇
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): A01N1/02
• 分類(lèi)號(hào): A01N1/02;C12N5/071
• 代理公司: 北京北新智誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11100
• 代理人: 王淳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及人體汗腺再生研究領(lǐng)域，更具體地，涉及一種令汗腺樣細(xì)胞可以保持活性的凍存復(fù)蘇的方法，及該方法中應(yīng)用的凍存液和復(fù)蘇液。

背景技術(shù)

皮膚是人體最大的器官，可排出機(jī)體25%的熱量以保持體溫相對(duì)恒定。大面積深度燒傷患者因汗腺被毀或其分泌管道被瘢痕組織堵塞而喪失了分泌汗液的功能，皮膚的體溫調(diào)節(jié)功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此，恢復(fù)大面積深度燒傷患者的排汗功能對(duì)于提高患者生活質(zhì)量意義重大。目前研制出的人工皮膚均無(wú)汗腺等皮膚附屬器，無(wú)法解決這一問(wèn)題。間充質(zhì)干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞分化與汗腺細(xì)胞種植的研究為此帶來(lái)了希望。但誘導(dǎo)后汗腺樣細(xì)胞凍存復(fù)蘇后存活效率低，只有30%左右，不利于復(fù)蘇應(yīng)用。

目前，在細(xì)胞凍存時(shí)可用的凍存液包括血清和血清替代物兩類(lèi)，由于血清具有成分不明確、質(zhì)量不穩(wěn)定、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，利用血清替代物進(jìn)行細(xì)胞凍存和復(fù)蘇已成為發(fā)展趨勢(shì)。特別是臨床應(yīng)用級(jí)細(xì)胞的儲(chǔ)存，血清的成分復(fù)雜性使得若將其應(yīng)用于臨床尚存在很多未知的風(fēng)險(xiǎn)，因此臨床上普遍使用血清替代物作為細(xì)胞凍存液。常規(guī)的血清替代物凍存液主要成分是70%的無(wú)血清培養(yǎng)基、20%牛血清白蛋白和10%二甲基亞砜。一般采用簡(jiǎn)單的兩步法降溫凍存，具體方法是：將血清替代物凍存液加入細(xì)胞懸液后放入凍存管中，置于-80℃冰箱過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮中保存。對(duì)凍存細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，一般是將凍存管直接置于37℃迅速解凍，再加入完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，離心后棄去上清，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的在于提供一種令汗腺樣細(xì)胞可以保持活性的凍存復(fù)蘇的方法，及該方法中應(yīng)用的凍存液和復(fù)蘇液。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種汗腺樣細(xì)胞凍存液，其是在作為基礎(chǔ)液的血清替代物中添加以下組分配制而成：人表皮生長(zhǎng)因子，濃度為50-100ng/mL；重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-Ⅱ，濃度為10-100ng/mL；三碘甲狀腺原氨酸，濃度為10-50ng/mL；半琥珀酸氫化可的松，濃度為0.5-1μg/mL；胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉，濃度為0.01-0.2mL/mL；牛血清白蛋白，濃度為0.01-1g/mL。

如上所述的凍存液，優(yōu)選地，所述人表皮生長(zhǎng)因子的濃度為60-90ng/mL；所述重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-Ⅱ的濃度為20-60ng/mL；所述三碘甲狀腺原氨酸的濃度為20-40ng/mL；所述半琥珀酸氫化可的松的濃度為0.6-0.9μg/mL；所述胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉的濃度為0.03-0.15mL/mL；所述牛血清白蛋白的濃度為0.1-0.8g/mL。

如上所述的凍存液，更優(yōu)選地，所述人表皮生長(zhǎng)因子的濃度為70-80ng/mL；所述重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-Ⅱ的濃度為30-50ng/mL；所述三碘甲狀腺原氨酸的濃度為25-30ng/mL；所述半琥珀酸氫化可的松的濃度為0.7-0.8μg/mL；所述胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉的濃度為0.05-0.1mL/mL；所述牛血清白蛋白的濃度為0.3-0.6g/mL。

如上所述的凍存液，優(yōu)選地，所述血清替代物為Knock-out血清替代物（Knock-out?Serum?Replacement，Invitrogen公司，美國(guó)）。

一種汗腺樣細(xì)胞復(fù)蘇液，其是在作為基礎(chǔ)液的血清替代物中添加以下組分配制而成：人表皮生長(zhǎng)因子，濃度為50-100ng/mL；重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-Ⅱ，濃度為10-100ng/mL；三碘甲狀腺原氨酸，濃度為10-50ng/mL；半琥珀酸氫化可的松，濃度為0.5-1μg/mL；胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉，濃度為0.01-0.2mL/mL；牛血清白蛋白，濃度為0.01-1g/mL。

如上所述的復(fù)蘇液，優(yōu)選地，所述人表皮生長(zhǎng)因子的濃度為60-90ng/mL；所述重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-Ⅱ的濃度為20-60ng/mL；所述三碘甲狀腺原氨酸的濃度為20-40ng/mL；所述半琥珀酸氫化可的松的濃度為0.6-0.9μg/mL；所述胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉的濃度為0.03-0.15mL/mL；所述牛血清白蛋白的濃度為0.1-0.8g/mL。

如上所述的復(fù)蘇液，更優(yōu)選地，所述人表皮生長(zhǎng)因子的濃度為70-80ng/mL；所述重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-Ⅱ的濃度為30-50ng/mL；所述三碘甲狀腺原氨酸的濃度為25-30ng/mL；所述半琥珀酸氫化可的松的濃度為0.7-0.8μg/mL；所述胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉的濃度為0.05-0.1mL/mL；所述牛血清白蛋白的濃度為0.3-0.6g/mL。