[發明專利]雜色曲霉毒素的酶聯免疫吸附試劑盒制備及檢測方法

無效

• 申請號: 201210435692.3
• 申請日: 2012-11-05
• 公開（公告）號: CN103792360A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 杜道林;祝文珍
• 申請（專利權）人: 江蘇維賽科技生物發展有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543;G01N33/535;G01N21/31;C07K16/14
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技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體為對雜色曲霉毒素酶聯免疫吸附檢測專用試劑盒的制備及專業檢測。

背景技術

雜色曲霉素(ST)主要是雜色曲霉和構巢曲霉的最終代謝產物，同時又是黃曲霉和寄生曲霉生成黃血霉毒素過程后期的中間產物。據報道，感染了雜色曲霉的玉米在27℃的環境下，21天可產生雜色曲霉毒素12?g/kg以上。雜色曲霉毒素在1954年由雜色曲霉培養物中首先分離出的，但并未引起人們的足夠重視，至發現黃曲霉毒素的強致癌性后，才開始注意。用14~標記方法已證實雜色曲霉毒素能轉變成黃曲霉毒素馬，而且有人認為雜色曲霉毒素可能是非洲某些地區肝癌的病因。?

能產生ST的菌種主要是雜色曲霉、構巢曲霉和離蠕孢霉。此外，謝瓦曲霉、赤曲霉、焦曲霉、阿姆斯特丹曲霉、黃褐曲霉、四脊曲霉、變色曲霉、爪曲霉、毛殼霉及黃曲霉和寄生曲霉等也可產生ST。上述這些霉菌廣泛存在于自然界，?可污染大麥、小麥、玉米、花生、大豆、咖啡豆、火腿、奶酪等糧食、食品和飼草，尤其對小麥、玉米、花生等飼料和飼草污染更為嚴重。產毒量最高的是雜色曲霉，其次是構巢曲霉和離蠕孢霉，前者產生ST的量約為后者的2倍。

本發明為雜色曲霉毒素的酶聯免疫吸附檢測專用試劑盒。其檢測快速、靈敏、準確、可定量，操作簡便，且對樣品純度要求不高，特異性強，特別適用于大批量樣品的檢測。

發明內容

本發明提供了專用試劑盒的制備及檢測方法。其中包括洗滌液，顯色液，終止液。其特征在于：包有雜色曲霉毒素固相抗原的包被板、雜色曲霉毒素（ST）標準品，雜色曲霉毒素單克隆抗體、雜色曲霉毒素酶標抗體。

檢測時，取包被板，加入標準品/樣本50μL到對應的微孔中，再加入酶標記物50μL/孔，然后再加入50μL/孔抗體工作液，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應30?min。小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加洗滌液?250?μL/孔，每次浸泡15~30?s，充分洗滌4~5次，用吸水紙拍干。加入顯色液100?μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環境反應15?min。每孔各加50?μL終止液，設定酶標儀在450?nm處，測定OD值（建議用450/630?nm雙波長檢測，在5?min內讀完數據）。從標準曲線中計算樣品中ST的含量。測得的標準液或樣品吸光度的平均值（B）除以第一個標準液（0標準液）的吸光度（B₀）值再乘以100%，得到百分吸光度值，

百分吸光度值（%）＝B/B₀×100%

以標準品濃度的10為底的對數為X軸，?百分吸光值為Y軸，繪制標準曲線。將樣本的百分吸光值代入標準曲線，從標準曲線上讀出樣本所對應的值，作為10的冪，乘以稀釋倍數，即為樣品中所含雜色曲霉毒素的量。

附圖說明

圖1為雜色曲霉毒素標準曲線圖。

具體實施方式

實施例1?樣本前處理方法

準確稱取5.00?g樣品，加45?mL乙腈，5?mL含有4%KCl的40％硫酸溶液后，在振蕩機上振蕩30?min傾出清液，再用10?mL乙腈分兩次洗殘渣，收集乙腈液并與上述提取液合并，合并的提取液用石油醚脫脂三（石油醚用量為20，15，10?mL），脫脂后的提取液加水25mL，用氯仿萃取三次（氯仿用量為20，15，10mL），收集的氯仿層在低溫（-6℃）下冷凍，然后過濾去冰，去脂，用旋轉蒸發器蒸干（溫度40℃以下），殘渣用樣品稀釋液溶解后供色譜測定用。

實施例2?雜色曲霉毒素的酶聯免疫吸附試劑盒制備

1、雜色曲霉毒素固相抗原的包被板制作，包括包被原的制作封閉、液的配置、以及孵育。把包被原加入包被液用作固相抗原的包板制作。包被液：1.6?g碳酸鈉加上2.9?g碳酸氫鈉，加雙蒸水至1000?mL，調節pH至9.6。封閉液：1?gBSA，100mLPBS。包板時每孔100?μL包板液，37℃下孵育2?h，后取出洗板兩次，加封閉液，每孔180?μL，37℃下孵育1.5?h，取出甩干，加干燥劑2~8℃保存；

2、包被原的偶聯：