[發明專利]雜色曲霉毒素的酶聯免疫吸附試劑盒制備及檢測方法

無效

• 申請號: 201210435692.3
• 申請日: 2012-11-05
• 公開（公告）號: CN103792360A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 杜道林;祝文珍
• 申請（專利權）人: 江蘇維賽科技生物發展有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543;G01N33/535;G01N21/31;C07K16/14
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1.雜色曲霉毒素試劑盒的制備，包括洗滌液，顯色液，終止液；其特征在于：包有雜曲霉毒素固相抗原的包被板、雜色曲霉毒素（ST）標準品，雜色曲霉毒素單克隆抗體、雜色曲霉毒素酶標抗體。

2.雜色曲霉毒素固相抗原的包被板制作，包括包被原的制作、封閉液的配置、以及孵育；包被原的偶聯：根據雜色曲霉的結構特征偶聯載體蛋白BSA方法如下：

碳二亞胺（EDC）法偶聯雜色曲霉毒素半抗原與蛋白載體；???取5?mg?雜色曲霉毒素半抗原和2.5?mg?cBSA溶解在250?μLTE?buffer（pH?8.0）中，充分震蕩使其溶解，再取EDC·HCl?79?mg充分溶解于250?μL?TE?buffer（pH?8.0）中；將雜色曲霉毒素半抗原和cBSA的混合溶液邊震蕩邊逐滴加入EDC溶液，在37℃搖床中反應2?h以上；先用Sephadex柱分離偶聯產物和未結合的雜色曲霉毒素半抗原小分子；再透析純化，將0.5?mL溶液在PBS中透析3?d，每天換液兩次，每次換液200?mL；制得的雜色曲霉毒素偶聯物透析產物小劑量分裝，于-20℃保存，備用；包被原加入包被液用作固相抗原的包板制作；包被液：1.6?g碳酸鈉加上2.9?g碳酸氫鈉，加雙蒸水至1000?mL，調節pH至9.6；封閉液：1?g?BSA，100?mL?PBS；包板時每孔100?μL包板液，37℃下孵育2?h，后取出洗板兩次，加封閉液，每孔180?μL，37℃下孵育1.5?h，取出甩干，加干燥劑2~8℃保存。

3.根據權利要求書第一條所述，雜色曲霉毒素單克隆抗體制備方法

I材料和方法

（1）試劑

人工抗原：雜色曲霉毒素-牛血清白蛋白復合物?，弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑，L-谷氨酰胺，牛血清白蛋白第五部分，聚乙二醇-1000，?2,?6,?10,?14-四甲基十五烷(Pristane?)，鄰苯二胺，二甲基亞砜，Tris，?Hepes?pH緩沖劑，免疫球蛋白，辣根過氧化氫酶，鼠抗IgG等，其它常規化學試劑均為優級純、分析純試劑；

（2）免疫動物

?8周齡BALB/c雄性小鼠用人工抗原雜色曲霉毒素-BSA進行二次免疫；每只小鼠基礎免疫劑量為100?μg腹腔注射；24?d后加強免疫，劑量為每只小鼠100?μg，尾靜脈注射，4?d后取脾融合；

（3）細胞融合

免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞Sp-2/0以10：1混合；

用50%分子量為1000的聚乙二醇作融合劑，融合細胞用含20%小牛血清的HAT選擇性培養基懸浮后，接種于類似小鼠腹腔巨噬細胞作飼養層的96孔培養板中，于50%?CO2，37℃條件下培養7?d后，每培養孔更換2/3HT培養液；9?d后，開始對鏡檢有雜交瘤克隆生長的培養孔，取上清液進行篩選，對檢測結果呈陽性的細胞立即用有限稀釋法進行克隆化；

（4）腹水抗體純化

用硫酸銨鹽析法純化腹水抗體；

（5）雜交瘤篩選及抗體檢測

雜交瘤篩選用固相抗原間接競爭性ELISA法進行：包被抗原雜色曲霉毒素-BSA的濃度為15?μg/mL，每孔加量120?μL；每孔所含抗體抗原反應物由80?μL培養上清液+2?μL經紫外分光光度計標定濃度的雜色曲霉毒素?(10?μg/mL)組成；檢測對照中的抗原部分則用20?μL毒素稀釋液(20%MeOH-PBS)代替；酶底物用鄰苯二胺（OPD）；其它按標準方法進行；

（6）抗體的特性

①抗體滴度：

用固相抗原間接非競爭性ELISA測定，測試條件為：包被抗原為雜色曲霉毒素-BSA，濃度15?μg/mL，每孔加量150?μL；抗體從100倍開始對倍稀釋，每孔加量130?μL；抗體稀釋液為0.1%的BSA-PBS；陰性對照孔用SP-2/0骨髓瘤細胞培養上清液；封閉液為1%?BSA-PBS，每孔加量250?μL；酶底物用OPD，其它按標準方法進行；

②檢測標準毒素靈敏度：

先用棋盤滴定法篩選出包被抗原濃度和抗體工作稀釋度的優化組合，以此為測試條件，用固相抗原間接競爭性ELISA法做出雜色曲霉毒素的標準抑制曲線，并對結果進行數理統計分析；其中ELISA測試條件為：包被抗原雜色曲霉毒素-BSA的濃度為5?μg/mL，每孔加量150?μL；抗體工作稀釋度1：25600；抗體稀釋液為0.1%?BSA-PBS；抗體抗原反應液為每孔65?μL抗體+65?μL相應濃度雜色曲霉毒素；封閉液為1%?BSA-PBS，每孔加量250?μL；酶底物為OPD；陰性對照用Sp-2/0骨髓瘤細胞培養上清液，其它按標準方法進行；

③抗體的特異性：

用固相抗原間接競爭性ELISA法測定，參試毒素為雜色曲霉毒素，構巢曲霉，黃曲霉，寄生曲霉，黃曲霉毒素馬；其它測試條件同②；

④抗體亞類分析：

用免疫雙擴散法進行；

⑤抗體的親和力：

Friguet法，對應小鼠IgG標準曲線滴定出抗體IgG含量，再對應抗體滴度曲線求出平衡態下，抗體使抗原達到半飽和時的游離抗體克分子濃度[Ab]，代入下式求出抗體的親和常數K（L/moL)，

Ka＝１/[Ab]

（7）樣品中雜色曲霉毒素提取與純化

II結果與討論

（1）細胞融合與雜交瘤細胞的篩選細胞融合后，約57.?6%?的孔中長出雜交瘤克隆，其中抗體檢測陽性率約為88%；從中選擇對抗原有強抑制作用的孔，經多次亞克隆，建立了5個穩定分泌抗雜色曲霉毒素單克隆抗體的雜交瘤細胞株，各細胞株經兩次亞克隆以后，陽性率已達到100%?；第3次克隆化時有反復(疑為假明性)，所以進行了4次亞克隆；將上述抗體純化，即可。