[發明專利]一種快捷有效的窖泥古菌群落分析方法

無效

• 申請號: 201210435362.4
• 申請日: 2012-11-05
• 公開（公告）號: CN102912025A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發明（設計）人: 周榮清;何翠容;鄭佳
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種窖泥微生物群落的分析方法，尤其是濃香型白酒窖泥古菌群落及多樣性特征的分析方法。

背景技術

隨著分子生物學技術的快速發展，以PCR技術為核心的現代分子生物學免培法被廣泛應用于環境微生物群落及多樣性特征的評價。高質量、高純度基因組DNA的提取是成功進行PCR擴增及環境微生物群落特征解析的首要前提。然而，由于微生物細胞結構的復雜性及采樣環境的特殊性，提取的粗DNA往往含量低、純度低。研究表明，腐殖質及其類似物對環境基因組DNA的污染及提取過程微生物細胞破壁是否充分均是影響DNA質量的關鍵因素。目前已有諸多關于底泥、土壤、沉積物、活性污泥等基因組DNA提取過程去除腐殖質及細胞破壁處理的相關報道。有如專利申請號為201010183580.4記載了一種池塘底泥樣品高純度總DNA的提取方法，具體涉及樣品總DNA提取前采用EDTA及PBS緩沖液對池塘底泥進行預處理，并將提取的粗DNA過柱純化。有如專利申請號為201110089153.4公布了一種厭氧反應器中活性污泥DNA的提取方法，其特征在于結合了TENP、PBS緩沖液進行預處理及細胞破壁過程的反復凍融，以提高DNA的含量及純度。有如專利申請號為201210107413.0報道了一種大曲酒窖泥微生物總DNA提取的前處理方法，通過含吐溫-80的滅菌生理鹽水、無水乙醇及無菌水進行反復洗滌以去除窖泥中的酸、醇及酯類組分。然而，柱純化必然會導致基因組DNA的大量損失，反復凍融過程未必能將古菌細胞壁有效裂解，對DNA的釋放有一定局限性。同時，由于釀酒窖池窖泥處于高酸、高醇的特殊微環境及古菌的復雜細胞結構，如窖泥特征性古菌產甲烷菌的細胞壁含假肽聚糖，甲烷八疊球菌不含假肽聚糖而含復雜聚多糖，不受溶菌酶和內酰胺抗生素的作用。前述方法應用于研究窖泥古菌群落結構均存在一定局限性。因此，一種針對腐殖質污染及古菌特殊細胞結構的DNA提取、擴增的方法顯得十分必要。

發明內容

針對現有窖池窖泥微生物群落多樣性分析技術手段的局限性，本發明的目的在于提供一種針對腐殖質污染及古菌特殊細胞結構的DNA提取、擴增方法。

本發明采用了以下技術方案：

1）樣品預處理：

稱取5g樣品，加入20mL無菌PBS，充分混勻，加入5mL?0.1mol/L硫酸鋁溶液，輕搖混勻后800r/min離心，收集上清液；重復洗滌沉淀并合并上清液，該過程可視上清液渾濁程度添加適量0.1mol/L硫酸鋁溶液，10000r/min離心10min，棄上清液。

2）基因組DNA提?。?/p>

①將1）所得沉淀溶解于500μLDNA提取緩沖液（0.1M?Tris-HCl，0.1M?EDTA，1.5M?NaCl，1%CTAB，pH8.0），加入溶菌酶（100mg/mL）、纖維素酶（200mg/mL）、蝸牛酶（100mg/mL）及消化肽酶（250U/mL）?各20μL，37℃水浴2h；

②向上述樣品中加入20%?SDS?25μL，65℃保溫1.5h；

③向上述樣品中加入10μL蛋白酶K（250mg/mL），55℃水浴搖床1h，?5000r/min離心4min，轉移上清液；

④向上述上清液中加入等體積酚：氯仿：異戊醇（25:24:1），搖勻，10000r/min離心10min，收集上清液；

⑤向上述上清液中加入等體積氯仿：異戊醇（24:1），搖勻，10000r/min離心10min，收集上清液；

⑥向上述上清液中加入0.6倍體積預冷的異丙醇，-20℃下放置2h以上，10000r/min離心20min，去上清液，沉淀用預冷的70%乙醇洗滌1~2次后吹干；

⑦將DNA溶解于50~100μL?TE中，-20℃保存。

3）PCR擴增

PCR擴增采用巢式PCR方式進行，第一輪擴增體系為50?uL：25uL?2×Taq?Master?Mix，引物PRA46f/PREA1100r?（10umol/L）各2uL，模板2uL，ddH₂O補足50uL；第二輪擴增體系為50uL：25uL?2×Taq?Master?Mix，引物PARCH340f-GC/PARCH519r（10umol/L）各2uL，第一輪擴增產物2uL，ddH₂O補足50uL。