[發明專利]一種快捷有效的窖泥古菌群落分析方法

無效

• 申請號: 201210435362.4
• 申請日: 2012-11-05
• 公開（公告）號: CN102912025A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發明（設計）人: 周榮清;何翠容;鄭佳
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種快捷有效的窖泥古菌群落分析方法，其特征在于該方法包括如下步驟：

1）樣品預處理：

①稱取5g樣品，加入20mL無菌PBS，充分混勻，加入5mL?0.1mol/L硫酸鋁溶液，輕搖混勻后800r/min離心，收集上清液；

②重復洗滌沉淀并合并上清液，該過程可視上清液渾濁程度添加適量0.1mol/L硫酸鋁溶液，10000r/min離心10min，棄上清液。

2）基因組DNA提取：

①將1）所得沉淀溶解于500μLDNA提取緩沖液（0.1M?Tris-HCl，0.1M?EDTA，1.5M?NaCl，1%CTAB，pH8.0），加入溶菌酶（100mg/mL）、纖維素酶（200mg/mL）、蝸牛酶（100mg/mL）及消化肽酶（250U/mL）?各20μL，37℃水浴2h；

②向上述樣品中加入20%?SDS?25μL，65℃保溫1.5h；

③向上述樣品中加入10μL蛋白酶K（250mg/mL），55℃水浴1h，?5000r/min離心4min，轉移上清液；

④向上述上清液中加入等體積酚：氯仿：異戊醇（25:24:1），搖勻，10000r/min離心10min，收集上清液；

⑤向上述上清液中加入等體積氯仿：異戊醇（24:1），搖勻，10000r/min離心10min，收集上清液；

⑥向上述上清液中加入0.6倍體積預冷的異丙醇，-20℃下放置2h以上，10000r/min離心20min，去上清液，沉淀用預冷的70%乙醇洗滌1~2次后吹干；

⑦將DNA溶解于50~100μL?TE中，-20℃保存。

3）PCR擴增??????????????????

PCR擴增采用巢式PCR方式進行，第一輪擴增體系為50uL：25uL?Taq酶反應體系混合液，引物PRA46f/PREA1100r?（10umol/L）各2uL，模板2uL，ddH₂O補足50uL；第二輪擴增體系為50uL：25uL?Taq酶反應體系混合液，引物PARCH340f-GC/PARCH519r（10umol/L）各2uL，第一輪擴增產物2uL，ddH₂O補足50uL。

擴增條件為92℃預變性2min，92℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環，最后72℃延伸6min，產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗。DGGE變性劑濃度梯度為35%~65%，1×TAE電泳緩沖液，60℃，130V，電泳5h后SYBR?Green?I立即染色。

2.根據權利要求1所述一種有效的窖泥古菌群落分析方法，其特征在于所述步驟3）中Taq酶反應體系混合液為2×Taq?Master?Mix。