[發明專利]一種目標基因捕獲方法及其應用

有效

• 申請號: 201210434984.5
• 申請日: 2012-11-02
• 公開（公告）號: CN102925428A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 肖珊;李萍;陶曄;林芹;胡秋萍
• 申請（專利權）人: 上海美吉生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C40B40/08
• 代理公司: 上海光華專利事務所 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，尤其涉及一種基于文庫的目標基因捕獲方法及其應用。

背景技術

BAC、PAC、YAC等克隆載體的構建為基因克隆提供了有力工具。在已知基因部分序列信息的情況下，為了獲得基因全長序列，現有的技術中，主要有兩種方法。第一種可行的方法是從BAC、PAC或YAC文庫中利用聚合酶鏈式反應（Polymerase?Chain?Reaction，PCR）的方法擴增帶有目標片段的克??；第二種方法是利用特異序列重組BAC、PAC或YAC文庫，獲得帶有目標片段的陽性克隆?？梢钥吹?，兩種方法都需要構建BAC、PAC或YAC基因組文庫，但BAC、PAC、YAC文庫構建及重組操作復雜、保存不穩、價格昂貴、周期長、步驟繁瑣,并且第一種方法PCR擴增假陽性率高、第二種方法重組效率極低，大大限制了對中小片段基因功能的研究。

Red重組技術可簡單的實現對基因進行敲除、敲入、點突變等操作，還可在靶基因的上下游加入適當的啟動子和終止子序列以調節基因的表達。廣泛應用于構建具有特定突變的工程菌，改變生物代謝途徑，阻斷副反應的進行，防止副產物或有毒產物形成，促進目的產物積累等方面。

Murphy(1998)較早利用質粒pTP223表達Red重組酶,使線性DNA片段與染色體發生重組,構建的大腸桿菌基因缺陷重組效率大大提高；Zhang等(2000)利用Red重組技術將一段兩端與靶基因兩翼同源的序列(各有42bp)、中間為藥物抗性基因的線性DNA片段和含有靶基因的載體同時電轉入菌株細胞,抗性基因成功地將靶基因置換下來；,Yu等(2000)利用這種Red重組系統將大腸桿菌染色體和質粒上多個靶基因敲除。Ellis（2001）等在將70bp的單鏈DNA與染色體DNA進行重組,修復galKtyr145am琥珀突變和刪除313kb長的基因片段獲得了同樣高的重組效率。Datsenko等（2000）在Red重組酶的作用下,PCR片段借助兩端與靶基因兩翼同源的序列與染色體上對應區域發生重組,染色體上的靶基因被抗性基因所替代。Marta?Nedelkova等（2011）構建了GB05RedTrfA+pSC101β菌株，使大片段的同源重組的效率獲得提高。但是上述重組技術的改進仍克服不了基于大片段基因組文庫的目標基因捕獲技術操作復雜、價格昂貴、周期長的缺點，不便于研究中小片段基因功能。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術中的缺陷，提供一種目標基因捕獲方法極其應用。

本發明一方面提供了一種目標基因捕獲方法，包括：將打斷成2-4k的基因組DNA片段與載體連接獲得重組載體；重組載體電轉化GB05RedTrfA+pSC101β感受態細胞，培養獲得重組載體細菌文庫；制備帶篩選標記的待捕獲目標基因的雙鏈DNA重組片段；將重組片段與重組載體細菌文庫中的陽性克隆重組，篩選陽性克隆獲得含有目標基因片段的細菌克隆。

具體的，包括下列步驟：

1）獲取基因組DNA，將基因組DNA打斷成片段大小主要為2-4k的片段，使用瓊脂糖凝膠電泳回收大小為2-4k的片段，對回收片段進行末端補平；

2）將打斷并補平末端的片段與含有氨芐抗性的載體連接獲得重組載體；

3）將步驟2）獲得的重組載體電轉入用GB05RedTrfA+pSC101β做的感受態細胞，并在合適的條件下在固體培養基平板上培養感受態細胞直至長出大量含有重組載體的克隆，得到重組載體細菌文庫；

4）制備重組片段：制備兩翼為待捕獲目標基因的同源臂，中間插入篩選標記的雙鏈DNA重組片段；

5）重組：將步驟4）制備的重組片段與重組載體細菌文庫中的陽性克隆重組，利用所述雙鏈DNA重組片段中的篩選標記篩選獲得含有目標基因片段的細菌克隆。

其中，步驟1）中：

所述目標基因捕獲是指：在已知某一基因部分序列（基因序列片段）的情況下，通過實驗方法從相應物種的基因組DNA中獲得該基因的全部序列。

提取基因組DNA的方法可采用常規手段，如CTAB法、SDS法、苯酚抽提法、濃鹽法和煮沸法等。

由于本發明的方法對于高等動植物復雜基因的研究特別適用，因此，所述基因組DNA優選來自高等動植物。