[發(fā)明專利]一種目標(biāo)基因捕獲方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210434984.5
• 申請(qǐng)日: 2012-11-02
• 公開（公告）號(hào): CN102925428A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖珊;李萍;陶曄;林芹;胡秋萍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C40B40/08
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

1.一種目標(biāo)基因捕獲方法，包括：將打斷成2-4k的基因組DNA片段與載體連接獲得重組載體；重組載體電轉(zhuǎn)化GB05RedTrfA+pSC101β感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)獲得重組載體細(xì)菌文庫(kù)；制備帶篩選標(biāo)記的待捕獲目標(biāo)基因的雙鏈DNA重組片段；將重組片段與重組載體細(xì)菌文庫(kù)中的陽(yáng)性克隆重組，篩選陽(yáng)性克隆獲得含有目標(biāo)基因片段的細(xì)菌克隆。

2.如權(quán)利要求1所述目標(biāo)基因捕獲方法，具體包括下列步驟：

1）獲取基因組DNA，將基因組DNA打斷成片段大小主要為2-4k的片段，使用瓊脂糖凝膠電泳回收大小為2-4k的片段，對(duì)回收片段進(jìn)行末端補(bǔ)平；

2）將打斷并補(bǔ)平末端的片段與含有氨芐抗性的載體連接獲得重組載體；

3）將步驟2）獲得的重組載體電轉(zhuǎn)入用GB05RedTrfA+pSC101β做的感受態(tài)細(xì)胞，并在合適的條件下在固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)感受態(tài)細(xì)胞直至長(zhǎng)出大量含有重組載體的克隆，得到重組載體細(xì)菌文庫(kù)；

4）制備兩翼為待捕獲目標(biāo)基因的同源臂，中間插入篩選標(biāo)記的雙鏈DNA重組片段；

5）將步驟4）制備的重組片段與重組載體細(xì)菌文庫(kù)中的陽(yáng)性克隆重組，利用所述雙鏈DNA重組片段中的篩選標(biāo)記篩選獲得含有目標(biāo)基因片段的細(xì)菌克隆。

3.如權(quán)利要求2所述目標(biāo)基因捕獲方法，其特征在于，步驟1）中，采用CTAB法、SDS法、苯酚抽提法、濃鹽法或煮沸法獲取基因組DNA。

4.如權(quán)利要求2所述目標(biāo)基因捕獲方法，其特征在于，步驟1）中，使用DNA打斷儀將基因組DNA打斷成大小為2-4K的片段。

5.如權(quán)利要求2所述目標(biāo)基因捕獲方法，其特征在于，步驟1）中，所述含有氨芐抗性的載體選自PUC19載體、PUC18載體或pMD18-T載體。

6.如權(quán)利要求2所述目標(biāo)基因捕獲方法，其特征在于，步驟3）中，培養(yǎng)溫度約30℃。

7.如權(quán)利要求2所述目標(biāo)基因捕獲方法，其特征在于，步驟4)中，所述同源臂的長(zhǎng)度為40-60bp，所述篩選標(biāo)記與步驟2）所采用的含有氨芐抗性的載體及步驟3）所選用的感受態(tài)細(xì)胞GB05RedTrfA+pSC101β中的抗性標(biāo)記進(jìn)行區(qū)分。

8.如權(quán)利要求7所述目標(biāo)基因捕獲方法，其特征在于，所述篩選標(biāo)記為卡那霉素抗性篩選標(biāo)記。

9.如權(quán)利要求2所述目標(biāo)基因捕獲方法，其特征在于，步驟5）中，重組具體步驟為：利用含有氨芐抗性的培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟3）獲得的重組載體細(xì)菌文庫(kù)中的陽(yáng)性克隆，然后以鼠李糖誘導(dǎo)步驟4）制備的重組片段與所述陽(yáng)性克隆重組，最后用重組片段中的篩選標(biāo)記篩選獲得含有目標(biāo)基因片段的細(xì)菌克隆。

10.一種基因組DNA文庫(kù)，采用包括下列步驟的方法制得：將打斷成2-4k的基因組DNA片段與含有氨芐抗性的載體連接獲得重組載體；重組載體電轉(zhuǎn)化GB05RedTrfA+pSC101β感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)獲得重組載體細(xì)菌文庫(kù)。

11.如權(quán)利要求10所述基因組DNA文庫(kù)，其特征在于，所述基因組DNA文庫(kù)采用權(quán)利要求2-6任一權(quán)利要求所述目標(biāo)基因捕獲方法中的步驟1）-步驟3）制得。

12.權(quán)利要求1-9任一權(quán)利要求所述目標(biāo)基因捕獲方法或權(quán)利要求10或11所述基因組DNA文庫(kù)在基因研究領(lǐng)域的用途。