[發明專利]一種快速測定真菌微生物農藥中活孢子含量的方法

無效

• 申請號: 201210434841.4
• 申請日: 2012-11-05
• 公開（公告）號: CN102899386A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 袁善奎;姜輝;崔曉嵐;王一喆;林榮華;瞿唯鋼;胡承勇;曲甍甍;周艷明
• 申請（專利權）人: 農業部農藥檢定所
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種生物農藥的檢測方法，具體涉及一種用于測定真菌微生物農藥中活孢子含量的方法。

背景技術

微生物農藥通常包括細菌、真菌和病毒微生物農藥。是直接利用細菌、真菌和病毒等產生的天然活性物質或生物活體本身開發的，對植物病蟲草割進行防治的農藥。這類農藥具有選擇性強，對人、畜、農作物和自然環境安全，不任務天敵、不易產生抗性等優點。微生物農藥中的含菌量(尤其是活菌量)是決定產品質量好壞和田間防治效果的重要因子，因此活菌量是微生物農藥產品質量檢測的一項重要技術指標。

由于微生物農藥的有效成分為活體，不能用化學農藥的分析儀器進行含量檢測。對于真菌微生物農藥，通常采用血球計數板結合孢子萌發的方法進行檢測，即先用血球計數板測定總的孢子含量(樣品稱量、稀釋、血球計數板計數、結果計算)，然后測定孢子萌發率(樣品稱量、稀釋、孢子培養、顯微觀察孢子萌發情況、結果計算)，最后計算活的孢子含量(總的含孢量×孢子萌發率)。上述方法存在以下主要缺點：操作繁瑣，在顯微鏡下不易區分真菌孢子和助劑顆粒，而且由于培養時間短，有的孢子尚未萌發，影響測定結果。

近年來，一些真菌微生物農藥如球孢白僵菌、綠僵菌、木霉、淡紫擬青霉等在國內陸續獲得登記，生產上和市場上急需建立這類農藥的快速、簡便、準確的產品質量檢測方法。

一種考慮是采用平板菌落計數的方法來直接獲得活孢子的含量，但是，按照普通用于細菌計數的平板菌落計數法對真菌進行操作的話，不同孢子的菌落會長在一起連成片，形成大的菌落，影響測定結果；而菌落太小時計數則看不清，且不能區分目標菌落和雜菌的菌落。因此，需要尋找改進的方法。

發明內容

本發明的發明目的是提供一種快速測定真菌微生物農藥中活孢子含量的方法，以簡化操作，獲得更為準確的檢測結果。

為達到上述發明目的，本發明采用的技術方案是：一種快速測定真菌微生物農藥中活孢子含量的方法，包括下列步驟：

(1)在真菌培養基中加入以重量計0.25‰～5‰的脫氧膽酸鈉，并制備成平板；

(2)將真菌微生物農藥樣品在含重量百分比0.05％～0.1％吐溫20或0.05％～0.1％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton?X-100)的滅菌水中浸泡20～40min，再振蕩20～40min；

(3)將步驟(2)處理后的樣品進行倍數梯度稀釋，分別將不同稀釋度的樣品均勻涂布在步驟(1)獲得的平板上，室溫下培養48～120h，其中，同一稀釋度制作至少2個重復樣品；

(4)統計各平板上的菌落數，其中菌落數在30個～300個的平板為有效計數平板；

(5)真菌微生物農藥中，活孢子的含量為：

C＝T×N×10，

式中：C是真菌農藥活孢子含量，單位為CFU/g；T是統計平板對應的稀釋倍數；N是同一稀釋倍數的多個有效計數平板上的平均菌落數。

脫氧膽酸鈉(Sodium?deoxycholate，CAS號：302-95-4)，中文別名為3α，12α-二羥-5β-膽烷酸鈉以及去氧膽酸鈉，系膽酸鹽，類似膽汁氣味，有強烈苦味，易吸濕，易溶于水，微溶于無水醇，不溶于醚，低毒，半數致死量(大鼠，經口)1370mg/kg，化學結構式如下：

脫氧膽酸鈉為離子型去垢劑，是一種應用較廣泛的生化試劑，其作用主要有：裂解細胞、溶解蛋白，尤其是可以溶解一些難溶于水的蛋白，如膜蛋白等。此外，膽酸鹽是重要的生物活性分子，能參與許多生理過程；被廣泛應用于粘膜和皮膚給藥的促吸收劑。

本發明將脫氧膽酸鈉添加到培養基中，能夠抑制真菌的菌落擴展，同時在低濃度下也不會讓真菌孢子致死，實現了采用平板菌落計數法一步直接獲得活孢子的含量，而且可以通過肉眼或菌落計數儀統計菌落數。

上述技術方案中，步驟(1)中，所述真菌培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基，將培養基高壓蒸汽滅菌，待冷卻到55～62℃時，向培養基中加入脫氧膽酸鈉，制備成平板。

步驟(2)中，所述振蕩在室溫、150rpm的條件下進行。

優選地，步驟(2)中，浸泡時間為30min，振蕩時間為30min。

步驟(3)中，采用10倍數梯度稀釋，同一稀釋度制作3個重復樣品。

由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點：