[發明專利]重組人長效白介素1受體拮抗劑融合蛋白的純化方法

無效

• 申請號: 201210433642.1
• 申請日: 2012-11-02
• 公開（公告）號: CN102952836A
• 公開（公告）日: 2013-03-06
• 發明（設計）人: 徐巖;李征;王海彬;陳樞青;沈其;聶磊;白驊
• 申請（專利權）人: 浙江海正藥業股份有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K19/00;C07K1/36;C07K1/22;C07K1/18;C12R1/84
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技術領域

本發明涉及蛋白質純化領域，更具體地，本發明提供了一種重組人長效白介素1受體拮抗劑融合蛋白的純化方法。

背景技術

作為一個主要的免疫調節因子，白介素-1(Interleukin-1，IL-1)在機體的免疫及能量代謝調節中起到重要的作用。研究發現，IL-1在自身免疫性疾病如類風濕關節炎(Rheumatoid?arthritis，RA)、多發性硬皮病(Systemic?sclerosis)、II型糖尿病(Type2?diabetes)、肥胖癥(Obesity)的發病過程中起到非常重要的作用，最近的研究表明，IL-1還與某些種類的心血管疾病的發生相關。

白介素1受體拮抗劑(Interleukin-1?receptor?antagonist，IL-1Ra)是人體內天然存在的一種蛋白質分子，其在體內可以與IL-1的受體特異性地結合，滅活相應的信號傳導途徑，從而對IL-1引起的機體損傷有保護作用。通過GenBank查詢可以得到人白介素1受體拮抗劑的全基因序列，本專利中IL-1Ra的基因序列對應GenBank號為M63099.1。美國食品和藥品管理局（FDA）在2001年11月批準Amgen（安進）公司的重組人IL-1Ra(Kineret?，Anakinra)上市，主要用于對常規藥物無效的頑固性類風濕關節炎患者，目前該藥也用于II型糖尿病的治療，并取得了良好的效果。Anakinra為大腸桿菌表達的重組IL-1Ra蛋白質，治療期間需每天注射給藥，頻繁的用藥加重了病人的身體、心理和經濟負擔，因此長效的IL-1Ra的研究開發具有重要意義。

將目的蛋白質與生物體內天然存在的蛋白質進行融合表達，是一種延長藥物生物學半壽期的主要方式之一。目前常用的載體蛋白質有兩種：人血清白蛋白（Human?serum?albumin，HSA），通過GenBank查詢可以得到人血清白蛋白的全基因序列，本專利中HSA基因序列對應GenBank號為NM_000477。通過酵母細胞分泌表達獲得融合蛋白，如美國HGS公司研制的長效HSA-干擾素融合蛋白，目前已經進入臨床使用。其在體內的平均半衰期為157個小時，只需每二周注射一次即可獲得比較滿意的臨床治療效果；另一種載體為免疫球蛋白的Fc片段，通常選擇CHO細胞作為宿主細胞進行表達，如上海中信國健藥業有限公司生產的益賽普注射液為人II型腫瘤壞死因子受體-抗體的融合蛋白，臨床上用于中度及重度活動性類風濕性關節炎患者的治療。

目前，陳樞青等已經構建了四種由HSA與IL1-Ra通過不同方式融合的重組人長效白介素1受體拮抗劑融合蛋白的表達載體，分別為pPIC9-HSA-IL1-Ra質粒、pPIC9-HSA-(G)_n-IL1-Ra質粒、pPIC9-IL1-Ra-HSA質粒和pPIC9-IL1-Ra-(G)_n-HSA質粒（專利號：ZL?200810060568.7），本發明將該專利全文引用，這四種表達載體通過電擊轉化插入到畢赤酵母菌株GS115或SMD1168中，表達出的四種融合蛋白分別為：HSA-IL-1Ra（無連接肽，本文簡稱HI融合蛋白）、HSA-(G)_n?-IL-1Ra（本文簡稱H(G)nI融合蛋白）、IL-1Ra-HSA（無連接肽，本文簡稱IH融合蛋白）、IL-1-(G)_n?-HSA（本文簡稱I(G)nH融合蛋白）；所述(G)_n的序列為[GlyGlyGlyGlySer]n，n為1-4?的整數。沈其等對HSA-G-IL-1Ra的搖瓶發酵液上清在實驗室規模進行純化，先經親和層析，最后用Q?Sepharose?XL層析得到純化產物（沈其，陳樞青.HSA／IL1ra融合蛋白的純化及生物學活性研究.浙江大學學報,2009,?Vol?38,No?3:260-264）。