[發(fā)明專利]重組人長效白介素1受體拮抗劑融合蛋白的純化方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210433642.1
• 申請日: 2012-11-02
• 公開（公告）號: CN102952836A
• 公開（公告）日: 2013-03-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐巖;李征;王海彬;陳樞青;沈其;聶磊;白驊
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江海正藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K19/00;C07K1/36;C07K1/22;C07K1/18;C12R1/84
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1.一種重組人長效白介素1受體拮抗劑融合蛋白的純化方法，該方法包括：

（1）將能夠表達(dá)重組人長效白介素1受體拮抗劑融合蛋白的基因工程菌株進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)，獲得含有目的蛋白的發(fā)酵液，經(jīng)預(yù)處理制得含目的蛋白的濃縮液，所述目的蛋白為HSA-IL-1Ra、HSA-（G）_n-IL-1Ra、IL-1Ra-HSA或IL-1Ra-（G）_n-HSA，其中（G）_n為肽接頭，G的序列為GlyGlyGlyGlySer，n為1-4的整數(shù)；?

（2）將上步所得的濃縮液進(jìn)行強(qiáng)陰離子交換層析，獲得含目的蛋白的洗脫液，所用層析介質(zhì)含有季銨基或季銨乙基配基且所用介質(zhì)的基質(zhì)為瓊脂糖或葡聚糖；

（3）將上步所得洗脫液進(jìn)行藍(lán)膠親和層析，獲得含目的蛋白的洗脫液，所用層析介質(zhì)含有Cibacron?Blue配基；

（4）將上步所得洗脫液進(jìn)行弱陰離子交換層析，獲得含目的蛋白的洗脫液，其中弱陰離子交換層析所用介質(zhì)含有二乙基氨基乙基配基，所述介質(zhì)的基質(zhì)為瓊脂糖、葡聚糖或聚甲基丙烯酸甲酯；所用洗脫目的蛋白的緩沖液含有10~50mM?NaH₂PO₄和20~35mM?NaCl，pH為5.5~6.5。

2.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述重組人長效白介素1受體拮抗劑融合蛋白為IL-1Ra-G-HSA融合蛋白，G的序列為GlyGlyGlyGlySer。

3.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，步驟1發(fā)酵中，目的蛋白的表達(dá)形式為分泌表達(dá)，所用表達(dá)載體為pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pPIC9或pPIC9K：當(dāng)載體為pPICZαA、pPICZαB或pPICZαC時，所用宿主細(xì)胞為巴斯德畢赤酵母X33；當(dāng)載體為pPIC9或pPIC9K時，所用宿主細(xì)胞為巴斯德畢赤酵母GS115或巴斯德畢赤酵母SMD1168。

4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的純化方法，其特征在于，步驟4所用的弱陰離子交換層析介質(zhì)選自DEAE?Sepharose?CL-6B、DEAE?Sepharose?F.F.、DEAE?Sephadex?A-50、DEAE-650M、DEAE-650C和Macro-Prep?DEAE，優(yōu)選DEAE?Sepharose?CL-6B。

5.如權(quán)利要求4所述的純化方法，其特征在于，步驟4中：層析前預(yù)先將柱平衡，所用平衡緩沖液含有10~50mM?NaH₂PO₄和20mM?NaCl，pH為5.5~6.5，優(yōu)選平衡緩沖液含有20mM?NaH₂PO₄和20mM?NaCl，pH為5.5或6.5；所用洗脫目的蛋白的緩沖液為含有20mM?NaH₂PO₄和35mM?NaCl、pH為5.5的緩沖液，或?yàn)楹?0mM?NaH₂PO₄和20mM?NaCl、pH?6.5的緩沖液。

6.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的純化方法，其特征在于，步驟2所述的強(qiáng)陰離子交換層析介質(zhì)為Q?Sepharose?Fast?Flow、QAE?Sephadex?A-50或QAE-550C，優(yōu)選Q?Sepharose?Fast?Flow。

7.如權(quán)利要求6所述的純化方法，其特征在于，步驟2中：層析前預(yù)先將柱平衡，所用平衡緩沖液A₁含有10~50mM?Tris和10~50mM?NaCl，pH為6.5~7.5，優(yōu)選平衡緩沖液A₁含有20mM?Tris和20mM?NaCl，pH為7.0；所用洗脫緩沖液B₁含有10~50mM?Tris和100~200mM?NaCl，pH為6.5~7.5，優(yōu)選洗脫緩沖液B₁含有20mM?Tris和160mM?NaCl，pH為7.0。

8.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的純化方法，其特征在于，步驟3所述的親和層析介質(zhì)選自AF-Blue?HC-650M、Blue?Sepharose?6?Fast?Flow?CL-6B、Capto?Blue、Capto?Blue(high?sub)和Affi-Gel?Blue，優(yōu)選AF-Blue?HC-650M。