[發明專利]一種鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯重組蛋白及其制備方法

有效

• 申請號: 201210433570.0
• 申請日: 2012-10-26
• 公開（公告）號: CN103509120A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 郭松林;關瑞章;王玉;馮建軍;林鵬;黃文樹
• 申請（專利權）人: 集美大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 連耀忠

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一兩種鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯重組蛋白及其制備方法。

背景技術

近20年來，我國淡水養殖魚類出現暴發性敗血癥，給養殖業帶來了不可估量的經濟損失，研究表明該病的主要病原菌為嗜水氣單胞菌和遲頓遲鈍愛德華氏菌。嗜水氣單胞菌(Aeromonas?hydrophila)和遲鈍愛德華氏菌（Edwardsiella?tarda）是鰻鱺的重要病原菌，在春夏交替時節能引起鰻鱺出血性敗血癥、肝腎腫大、爛鰓病、爛尾病等傳染性很強的疾病，人工養殖的美洲鰻鱺、歐洲鰻鱺和日本鰻鱺均可發生。水產養殖業長期使用化學藥物治療該病，由于產生耐藥性等原因，致使可用的安全藥物越來越少。最近可見有關嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌全菌滅活苗和亞單位疫苗相關的研究，但要應用這些研究成果對鰻鱺進行免疫以預防多種病原菌的侵害，需要對鰻鱺進行多次注射操作，對魚體傷害較大，且操作繁瑣。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術缺陷，提供一種可作為疫苗使用的鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯重組蛋白。

本發明的另一目的在于提供該二聯重組蛋白的制備方法。

本發明的一技術方案是：

一種鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯重組蛋白，包括連接在一起的嗜水氣單胞菌II型孔蛋白膜外部分和遲鈍愛德華氏菌ompS2膜外部分，其氨基酸序列分別如SEQ?ID?NO1的第271~544位和第1~257位所示。

在本發明的一個優選實施方案中，所述嗜水氣單胞菌II型孔蛋白膜外部分和遲鈍愛德華氏菌ompS2膜外部分通過一段連接肽連接在一起，該連接肽的序列如SEQ?ID?NO1的第258~270為所示。

本發明的另一技術方案是：

一種編碼所述鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯重組蛋白的基因序列，包括連接在一起的嗜水氣單胞菌II型孔蛋白膜外部分的編碼核苷酸序列和遲鈍愛德華氏菌ompS2膜外部分的編碼核苷酸序列，上述編碼核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO2的第831~1612位和第1~771位所示。

在本發明的一個優選實施方案中，所述嗜水氣單胞菌II型孔蛋白膜外部分的基因序列和遲鈍愛德華氏菌ompS2膜外部分的基因序列通過一段如SEQ?ID?NO2的第772~810位所示的編碼一段連接肽的核苷酸序列連接起來。

本發明的再一技術方案是：

一種表達所述鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯重組蛋白的質粒，包括負載有SEQ?ID?NO2所示核苷酸序列的原核表達載體。

在本發明的一個優選實施方案中，所述原核表達載體為融合表達載體。

本發明的再一技術方案是：

一種表達所述鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯重組蛋白的大腸桿菌，該大腸桿菌轉化有負載SEQ?ID?NO2所示核苷酸序列的原核表達載體。

在本發明的一個優選實施方案中，所述原核表達載體為融合表達載體。

在本發明的一個優選實施方案中，所述原核表達載體為pGEX-2T-His或pGEX-4T-2。

在本發明的一個優選實施方案中，所述用于表達的大腸桿菌為大腸桿菌BL21或大腸桿菌DH5α。

本發明的再一技術方案是：

一種上述鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯重組蛋白的制備方法，包括如下步驟：

（1）分別擴增編碼嗜水氣單胞菌II型孔蛋白膜外部分和遲鈍愛德華氏菌ompS2膜外部分的基因序列，其氨基酸序列分別如SEQ?ID?NO1的第271~544位和第1~257位所示，其核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO2的第831~1612位和第1~771位所示；

（2）將步驟（1）所得的兩個基因序列連接在一起，得到融合基因序列；

（3）將步驟（2）所得的融合基因序列連接到原核表達載體中，構建重組表達載體；

（4）將步驟（3）中所構建的重組表達載體轉化到原核宿主細胞中，并在適于表達所述融合基因的條件下培養被轉化的原核宿主細胞；

（5）回收并純化所培養的原核宿主細胞表達的融合蛋白；

（6）對步驟（5）所得的融合蛋白進行復性。

本發明的有益效果是：