[發明專利]一種乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的檢測方法

有效

• 申請號: 201210433127.3
• 申請日: 2012-11-02
• 公開（公告）號: CN103792298A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 梁艷;王艷萍;任新志;邵振國
• 申請（專利權）人: 內蒙古伊利實業集團股份有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司 11127
• 代理人: 姚亮

技術領域

本發明涉及一種乳制品中功能性成分的檢測方法，尤其涉及一種乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的檢測方法，屬于檢測技術領域。

背景技術

酪蛋白磷酸肽(casein?phosphopeptides，簡稱CPP)是以牛奶酪蛋白為原料經蛋白酶水解，再經分離純化而得到的含有磷酸絲氨酸族的天然生理活性肽，具有結合鈣和促進鈣吸收的功能，所以又被稱為促鈣吸收因子。

目前國內外對CPP原料中CPP含量的檢測方法一般采用BaCl₂-乙醇法，且乳制品中CPP的含量完全靠誠信添加。國內報道的對乳制品中CPP的檢測方法主要包括毛細管區帶電泳法、液相色譜-質譜聯用法和高效液相色譜法(HPLC)。毛細管區帶電泳法的干擾因索較多，不適于低含量CPP的檢測；液相色譜-質譜聯用法檢測成本高，不適于生產車間對產品的檢測；已報道的高效液相色譜法的文獻中沒有提到乳制品的純化方法，且在市面上無法買到CPP標準品，故該檢測方法在實際應用中很難重復。

目前檢測CPP成品中的CPP含量時，要先用BaCl₂-乙醇法檢測CPP原料中CPP的含量，再以該CPP原料的添加量來推算成品中的CPP含量，過程操作步驟繁瑣，耗時較長，一般需要2-3天才可以得到檢測結果，且檢測結果誤差較大，不適于現代化生產的要求。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明的目的在于提供一種乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的檢測方法。該檢測方法首先對CPP原料進行純化，將其作為標準品，再對經純化的CPP成品進行檢測，得到檢測結果。該檢測方法簡化了操作步驟，縮短了檢測時間，可以準確、有效的檢測出乳制品中酪蛋白磷酸肽的含量。

為達上述目的，本發明提供一種乳制品中酪蛋白磷酸肽的檢測方法，其包括以下步驟：

A、酪蛋白磷酸肽原料的純化

將酪蛋白磷酸肽原料溶解后，調整pH值為4.6，定容為0.2g/mL的酪蛋白磷酸肽原料溶液，靜置30min；

將上述溶液在4℃、5000rpm離心15min，取上清液，加入BaCl₂使其濃度為0.05M，混勻后，得到一含有BaCl₂的酪蛋白磷酸肽原料溶液；

以上述含有BaCl₂的酪蛋白磷酸肽原料溶液∶無水乙醇＝1∶2的體積比，在上述含有BaCl₂的酪蛋白磷酸肽原料溶液中加入無水乙醇，混勻后，在4℃靜置12-16小時；

將上述靜置后的溶液在4℃、5000rpm離心15min，棄去上清液，以上述含有BaCl₂的酪蛋白磷酸肽原料溶液∶H₂SO₄＝1∶0.4的體積比，在沉淀中加入濃度為0.125M的H₂SO₄，然后用濾紙過濾；

取濾液在60-70℃烘干60min，之后在105℃烘干至恒重，得到純化的酪蛋白磷酸肽原料；

B、標準曲線的繪制

將上述純化的酪蛋白磷酸肽原料用超純水制備濃度為0.1mg/100mL、0.5mg/100mL、1mg/100mL、5mg/100mL、10mg/100mL、20mg/100mL的系列標準工作液，采用高效液相色譜儀對該系列標準工作液進行檢測分析，繪制標準曲線；

C、酪蛋白磷酸肽成品的檢測

C1、樣品純化

C1.1、提取

當樣品為液態乳制品時：稱取20g樣品，用濃度為1％的三氯乙酸(質量濃度1％的三氯乙酸水溶液)定容至50mL，超聲10min，靜置過濾得待凈化液，其中，本領域一般技術人員可以根據實際情況對所述靜置步驟的時間進行調控，優選地，所述靜置的時間為10分鐘；所述過濾步驟所使用的濾紙可以為常規的定性濾紙；

當樣品為固態乳制品時：稱取5g樣品，用濃度為1％的三氯乙酸溶解后定容至50mL，超聲10min，靜置過濾得待凈化液，其中，本領域一般技術人員可以根據實際情況對所述靜置步驟的時間進行調控，優選地，所述靜置的時間為10分鐘；所述過濾步驟所使用的濾紙可以為常規的定性濾紙；

C1.2、凈化

將固相萃取柱依次用3mL甲醇、3mL水活化，取適當體積的待凈化液轉移至固相萃取柱中，依次用3mL水和3mL甲醇洗滌，棄去淋洗液后用6mL氨化甲醇洗脫至10mL具塞試管中，整個固相萃取過程流速不超過1mL/min，將洗脫液于50℃下用氮氣吹干，得到殘留物；

C2、檢測及計算