[發明專利]快速檢測煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA方法及其應用

有效

• 申請號: 201210423231.4
• 申請日: 2012-10-30
• 公開（公告）號: CN102937652A
• 公開（公告）日: 2013-02-20
• 發明（設計）人: 謝艷;周雪平;吳建祥;矯曉陽;劉歡
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

技術領域

本發明所屬的領域為生物技術領域，尤其是涉及一種攜帶番茄黃化曲葉病毒的煙粉虱的快速檢測方法及應用。

背景技術

番茄黃化曲葉病毒（Tomato?yellow?leaf?curl?virus,?TYLCV）屬于雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus），該屬病毒在自然條件下只能由煙粉虱（Bemisia?tabaci）以持久方式傳播，因而又被稱為粉虱傳雙生病毒。番茄黃化曲葉病害的大規模流行往往伴隨著傳毒介體煙粉虱的爆發。在我國，番茄黃化曲葉病最初僅分布在海南、云南、廣東和廣西等省，自2006年上海和浙江先后在番茄上發現番茄黃化曲葉病毒以來，該病害在華東地區迅速蔓延開來，已在我國北京、上海、山東、新疆等18個省份的番茄上流行爆發。番茄黃化曲葉病導致番茄葉片上卷或下卷、葉片黃化、葉脈外突、植株矮化，嚴重時致番茄絕收。近年來，由于全球氣候變暖和農業發展格局的變化，煙粉虱在我國北方地區也呈爆發趨勢，使得番茄黃化曲葉病害在我國自南向北迅速擴散和蔓延開來，對番茄生產構成巨大威脅。

番茄黃化曲葉病毒不能機械傳播，不經卵傳播，只由煙粉虱成蟲以持久性方式傳播，且煙粉虱一旦獲毒，即終身帶毒。煙粉虱傳毒效率高，每株植株上只要1頭帶毒B型或Q型煙粉虱成蟲取食，則病毒傳毒率達50-55%，因此煙粉虱的爆發往往導致番茄黃化曲葉病害的大流行，在生產上造成巨大危害，經濟損失嚴重。實際生產中，田間煙粉虱是否攜帶番茄黃化曲葉病毒，帶毒率高低等問題往往難以掌握。近年來我國番茄黃化曲葉病毒病發生處于上升時期，暴發態勢仍將延續，利用現代科學技術提高我國對于番茄黃化曲葉病毒的早期監測和預警能力迫在眉睫。以往對于煙粉虱帶毒率的檢測只能依賴PCR的方法，而該方法受儀器依賴性強、成本高等限制只能檢測多頭煙粉虱的混合樣本，因而PCR方法得到的實驗數據只是個粗略值，無法明確單頭煙粉虱的帶毒情況。另外，由于植物與昆蟲的本質區別使得適用于植物的血清學方法無法應用到介體昆蟲的檢測中。

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發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種快速檢測煙粉虱體內攜帶番茄黃化曲葉病毒的方法及其應用。?

一種快速檢測煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA方法，包括如下步驟：

1）田間煙粉虱的采集、預處理及研磨；

2）硝酸纖維素（NC）膜準備：用鉛筆在NC膜外層紙上劃線，使NC膜印上方格線痕跡，每格規格1×1?cm，平整放入培養皿中央；

3）點樣：吸取研磨的煙粉虱研磨液2?μL，點樣于NC膜的格子中央；

4）封閉：點樣后，將NC膜靜置晾干10分鐘，使用按5?g脫脂奶粉加100?mL?PBST緩沖液（含0.05%?Tween-20的0.01?mol/L?PBS）的比例配制得到5%的脫脂奶粉封閉，37℃靜置.0.5-1小時；?

5）加一抗：加入中國專利申請號為201210004197.7的番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體，該單克隆抗體用5%的脫脂奶粉1:2000倍稀釋,?37℃孵育1小時；

6）洗滌：棄液體，NC膜用PBST緩沖液搖動洗脫5次，每次3分鐘；

7）加酶標二抗：棄洗脫液，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG二抗（A4416?Sigma），二抗用5%的脫脂奶粉1:1000倍稀釋，37℃孵育1小時；

8）洗滌：棄液體，NC膜用PBST緩沖液搖動洗脫5~6次，每次5分鐘；

9）顯色：棄洗脫液，將NC膜用濾紙吸干或靜置晾干，加入TMB顯色液（W4121?Promega）顯色，避光靜置5~10分鐘；

10）終止反應：待NC膜上的樣品呈現藍色而陰性對照未顯色時棄顯色液終止反應；

11）記錄結果：ddH_2?O浸泡NC膜，晾干后記錄結果。

所述的田間煙粉虱的采集、預處理及研磨包括如下步驟：

1）煙粉虱采集：從大田中用吸蟲器采集捕獲煙粉虱；?

2）煙粉虱存放：95%的酒精中室溫存放；

3）煙粉虱預處理：移液槍吸掉95%的酒精，ddH₂O清洗3遍，去掉酒精；

4）煙粉虱研磨：用毛筆蘸取單頭煙粉虱，置于干凈的封口膜上，室溫晾干5分鐘；晾干后，每頭煙粉虱滴加2?μL?0.05?mol/L?PBS緩沖液，用0.5?mL離心管底磨碎至肉眼不能看到明顯組織。