[發明專利]快速檢測煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA方法及其應用

有效

• 申請號: 201210423231.4
• 申請日: 2012-10-30
• 公開（公告）號: CN102937652A
• 公開（公告）日: 2013-02-20
• 發明（設計）人: 謝艷;周雪平;吳建祥;矯曉陽;劉歡
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

1.?一種快速檢測煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA方法，其特征在于包括如下步驟：

1）田間煙粉虱的采集、預處理及研磨；

2）硝酸纖維素（NC）膜準備：用鉛筆在NC膜外層紙上劃線，使NC膜印上方格線痕跡，每格規格1×1?cm，平整放入培養皿中央；

3）點樣：吸取研磨的煙粉虱研磨液2?μL，點樣于NC膜的格子中央；

4）封閉：點樣后，將NC膜靜置晾干10分鐘，使用按5?g脫脂奶粉加100?mL?PBST緩沖液的比例配制得到5%的脫脂奶粉封閉，37℃靜置0.5-1小時；所述的PBST緩沖液為含0.05%?Tween-20的0.01?mol/L?PBS；?

5）加一抗：加入中國專利申請號為201210004197.7的番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體，該單克隆抗體用5%的脫脂奶粉1:2000倍稀釋,?37℃孵育1小時；

6）洗滌：棄液體，NC膜用PBST緩沖液搖動洗脫5次，每次3分鐘；

7）加酶標二抗：棄洗脫液，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG二抗，二抗用5%的脫脂奶粉1:1000倍稀釋，37℃孵育1小時；

8）洗滌：棄液體，NC膜用PBST緩沖液搖動洗脫5~6次，每次5分鐘；

9）顯色：棄洗脫液，將NC膜用濾紙吸干或靜置晾干，加入TMB顯色液顯色，避光靜置5~10分鐘；

10）終止反應：待NC膜上的樣品呈現藍色而陰性對照未顯色時棄顯色液終止反應；

11）記錄結果：ddH_2?O浸泡NC膜，晾干后記錄結果。

2.?如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的田間煙粉虱的采集、預處理及研磨包括如下步驟：

1）煙粉虱采集：從大田中用吸蟲器采集捕獲煙粉虱；?

2）煙粉虱存放：95%的酒精中室溫存放；

3）煙粉虱預處理：移液槍吸掉95%的酒精，ddH₂O清洗3遍，去掉酒精；

4）煙粉虱研磨：用毛筆蘸取單頭煙粉虱，置于干凈的封口膜上，室溫晾干5分鐘；晾干后，每頭煙粉虱滴加2?μL?0.05?mol/L?PBS緩沖液，用0.5?mL離心管底磨碎至肉眼不能看到明顯組織。

3.?一種如權利要求1所述的方法的試劑盒，其特征在于包括以下步驟：

1）試劑盒試劑與材料：

0.05?mol/L?PBS???????????????????????????????????????10?ml

單克隆抗體??????????????????????????????????????????0.1?ml

HRP標記羊抗鼠IgG二抗??????????????????????????????0.1?ml

TMB顯色底物液?????????????????????????????????????10?ml

10×濃縮封閉液???????????????????????????????????????10?ml

10×濃縮抗體稀釋液???????????????????????????????????20?ml

20×濃縮洗滌液???????????????????????????????????????60?ml?

封閉劑??????????????????????????????????????????????15?g

NC膜???????????????????????????????????????????????5張

2)?試劑盒操作步驟：

2.1）單頭煙粉虱置于封口膜上，加入2-3?ul?0.05?mol/L?PBS，用0.5?ml離心管底磨碎；

2.2）取2?ul上清點到硝酸纖維素（NC）膜上，室溫干燥10分鐘;

2.3）NC膜浸入到含5%封閉劑的1×封閉液中室溫封閉30分鐘;

2.4）NC膜放入用1×抗體稀釋液1:?2000倍稀釋的單抗中室溫孵育30-60分鐘;

2.5）1×洗滌液洗膜3-4次，每次3分鐘;

2.6）NC膜放入用1×抗體稀釋液1:1000倍稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG二抗中室溫孵育30-60分鐘;

2.7）1×洗滌液洗膜5-6次，每次3分鐘;

2.8）用濾紙吸干膜后將TMB底物顯色液滴加到膜表面進行顯色反應，肉眼觀察結果，待陽性對照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時記錄檢測結果，顯色時間5-20分鐘。

4.?一種如權利要求1-3任一項所述的快速檢測煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA方法及其試劑盒的應用，其特征在于利用該方法對田間煙粉虱的帶毒情況進行調查，精確計算煙粉虱帶毒率，預測番茄黃化曲葉病在田間的流行爆發趨勢以及時采取防治措施。