[發明專利]肝素酶Ⅲ的固定化方法

有效

• 申請號: 201210423099.7
• 申請日: 2012-10-30
• 公開（公告）號: CN102888390A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發明（設計）人: 馬小來;白佳珂;史紹鵬;李鋰
• 申請（專利權）人: 深圳市海普瑞藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種肝素酶Ⅲ的固定化方法，尤其涉及一種以殼聚糖為固定化材料對肝素酶Ⅲ進行固定化的方法，實現肝素酶Ⅲ的固定化和可重復利用性。?

背景技術

肝素酶是指一類能夠特異性裂解肝素和類肝素主鏈糖苷鍵的酶，最初是從肝素黃桿菌中發現并分離出來的，其后又發現在一些微生物和動物組織中也有肝素酶存在。目前有學術論文報道的肝素酶大約有10多種，得到較為細致研究的只有來自肝素黃桿菌的3種酶，分別是肝素酶Ⅰ（EC編號4.2.2.7）、肝素酶Ⅱ（無EC編號）、肝素酶Ⅲ（EC編號4.2.2.8）。肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別是分子量大約43、78、66kd的單體蛋白質，其等電點均在9.0左右，應用和研究非常廣泛。?

肝素酶Ⅲ是一種主要以硫酸乙酰肝素為催化降解底物的酶，只對肝素鏈上極少的特定位點具有催化裂解作用。肝素酶Ⅲ對制備硫酸乙酰寡糖、研究肝素和硫酸乙酰肝素的結構有重要的作用。然而游離的肝素酶Ⅲ在發生反應時需要將其加入底物中，反應以后酶溶液、底物和產物混合在一起不容易分離，導致酶無法重復使用，利用效率低下，這為應用帶來很多不便，需要尋找一種能提高肝素酶Ⅲ利用效率的方法。?

與游離酶相比，固定化酶在保持其高效專一及溫和的酶催化反應特性的同時，又克服了游離酶的不足之處，具有分離回收容易、可多次重復使用、操作連續可控等一系列優點，因此，對肝素酶Ⅲ的固定化是一種提高使用效果的理想選擇。但目前對肝素酶Ⅲ進行固定化的研究未見報道。?

經過長期研究，本發明的發明人發現了一種高效并且低成本的肝素酶Ⅲ的固定化方法。籍此，本發明給出了一種以殼聚糖微球為材料對肝素酶Ⅲ固定化的方法，成功實現了肝素酶Ⅲ與底物和產物的分離，使酶的應用潛力更大。?

發明內容

本發明提供了一種用殼聚糖微球固定肝素酶Ⅲ的方法，包括下述步驟：?

（1）肝素酶Ⅲ溶液的制備：選擇Tris-HCl緩沖液（pH7.0，其中含CaCl₂）作為肝素酶Ⅲ的溶劑，將肝素酶Ⅲ溶解在該緩沖液中，制得肝素酶Ⅲ溶液；

（2）肝素酶Ⅲ與殼聚糖微球的交聯：將殼聚糖微球用Tris-HCl緩沖液（pH?7.0，?其中含10mM?CaCl₂）充分溶脹，再取步驟（1）獲得的肝素酶Ⅲ溶液?，將其加入該殼聚糖微球中，進行交聯；

（3）用乙酸-乙酸鈉和Tris-HCl兩種緩沖液分別洗滌上述交聯后的殼聚糖微球至洗脫液無酶活性；

（4）利用還原劑對步驟（3）中獲得的固定了肝素酶Ⅲ的殼聚糖微球進行處理，隨后，如果需要，除去殘余的還原劑，由此得到固定在殼聚糖微球上的肝素酶Ⅲ。

在上述實施方案中，優選步驟（1）中用于溶解肝素酶Ⅲ的溶劑Tris-HCl的濃度為10-50mM，?其中含CaCl₂濃度為10-100mM，最優選50mM?Tris-HCl（pH?7.0，其中含10mM?CaCl₂）；?

在上述實施方案中，優選步驟（1）中肝素酶Ⅲ在溶液中的濃度為0.1-100IU/ml，更優選為1-10?IU/ml，最優選為2-5?IU/ml。

在上述實施方案中，步驟（2）中所述殼聚糖微球可以通過現有技術中已知的制備方法進行制備，例如，可以采用反相懸浮法進行制備，其中使用的交聯劑可以由本領域技術人員適當選擇，例如應用最為廣泛的交聯劑為戊二醛。所述溶脹時間可以根據溶脹程度由本領域技術人員進行控制，例如，溶脹20分鐘。?

在上述實施方案中，優選步驟（2）中使用的殼聚糖微球與肝素酶Ⅲ溶液的體積比為1/10-10/1，更優選1/5-5/1，最優選1/2-2/1。?

在上述實施方案中，優選在步驟（2）中，交聯溫度為4-10℃，交聯時間為8-24h，更優選的交聯溫度為8-10℃，交聯時間為12-20h。?

在上述實施方案中，優選步驟（3）中使用的緩沖液為乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH?6.0-8.0），更優選為50-150mM乙酸-乙酸鈉（pH?6.5-8.0，其中含50-200mM?NaCl）緩沖液，最優選為100mM乙酸-乙酸鈉（pH?7.5，其中含100mM?NaCl）緩沖液。?