[發明專利]肝素酶Ⅲ的固定化方法

有效

• 申請號: 201210423099.7
• 申請日: 2012-10-30
• 公開（公告）號: CN102888390A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發明（設計）人: 馬小來;白佳珂;史紹鵬;李鋰
• 申請（專利權）人: 深圳市海普瑞藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種肝素酶Ⅲ的固定化方法，包括下述步驟：

（1）肝素酶Ⅲ溶液的制備：選擇Tris-HCl緩沖液（pH7.0，含CaCl₂）作為肝素酶Ⅲ的溶劑，將肝素酶Ⅲ溶解在該緩沖液中，制得酶溶液；

（2）肝素酶Ⅲ與殼聚糖微球的交聯：將殼聚糖微球用Tris-HCl緩沖液（pH?7.0，?含10mM?CaCl₂）充分溶脹，再取步驟（1）獲得的肝素酶Ⅲ溶液?，將其加入該殼聚糖微球中，進行交聯；

（3）用乙酸-乙酸鈉（pH?6.5-8.0，含NaCl）和Tris-HCl（pH?6.5-8.0，含CaCl₂和NaCl）兩種緩沖液分別洗滌上述交聯后的殼聚糖微球，至洗脫液無酶活性；

（4）利用還原劑處理步驟（3）中獲得的固定了肝素酶Ⅲ的殼聚糖微球，隨后，如果需要，除去殘余的還原劑，由此得到固定在殼聚糖微球上的肝素酶Ⅲ。

2.根據權利要求1的固定化方法，其特征在于，步驟（1）中用于溶解肝素酶Ⅲ的溶劑Tris-HCl的濃度為10-100mM，?CaCl₂濃度為5-20mM。

3.根據權利要求2的固定化方法，其特征在于，步驟（1）中使用的Tris-HCl溶劑為50mM?Tris-HCl（pH?7.0，含10mM?CaCl₂）。

4.根據權利要求1～3任一項的固定化方法，其特征在于，步驟（2）中使用的殼聚糖微球與肝素酶Ⅲ溶液的體積比為1/10-10/1，更優選1/5-5/1，最優選1/2-2/1。

5.根據權利要求1的固定化方法，其特征在于，步驟（3）中使用的乙酸-乙酸鈉緩沖液為50-150mM乙酸-乙酸鈉（pH?6.5-8.0，含50-200mM?NaCl）緩沖液。

6.根據權利要求1的固定化方法，其特征在于，步驟（3）中使用的Tris-HCl緩沖液為50mM?Tris-HCl（pH?6.5-8.0，含10-100mM?CaCl₂，50-200mM?NaCl）緩沖液。

7.根據權利要求1的固定化方法，其特征在于，步驟（4）中使用的還原劑為堿金屬硼氫化物。

8.根據權利要求1的固定化方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

（1a）、殼聚糖微球的制備：

取殼聚糖粉末溶于2%的乙酸中，制得酸性殼聚糖溶膠，將Span?80加入液體石蠟中，高速攪拌混合，將酸性殼聚糖溶膠逐滴加入液體石蠟中，乳化1h后，加入戊二醛作為交聯劑，交聯溫度為40℃，交聯完畢后加入2.5M?NaOH和無水乙醇（體積比1/1）的混合液，攪拌后靜置，棄去油層和水層，并用超純水反復洗滌，即得殼聚糖微球；

（1）配制緩沖液50mM?Tris-HCl（pH?7.0，含10mM?CaCl₂），將其作為肝素酶Ⅲ的溶劑，制得肝素酶Ⅲ溶液，調整濃度至酶活力1-3IU/ml；

（2）取步驟（1）獲得的肝素酶Ⅲ溶液?，將其加入用50mM?Tris-HCl（pH?7.0，含10mM?CaCl₂）充分溶脹過的步驟（1a）獲得的殼聚糖微球中，殼聚糖與肝素酶的體積比為1/2-2/1，4-10℃交聯12-20h；

（3）配制100mM乙酸-乙酸鈉（pH?7.5，含100mM?NaCl）和50mM?Tris-HCl（pH?7.5，含50mM?CaCl₂，100mM?NaCl）緩沖液，先后對交聯后的殼聚糖微球進行洗滌，緩沖液100mM乙酸-乙酸鈉（pH?7.5，含100mM?NaCl）洗脫體積為殼聚糖微球體積的兩倍，然后用緩沖液50mM?Tris-HCl（pH?7.5，含50mM?CaCl₂，100mM?NaCl）洗滌，收集洗脫液測酶活，直至洗脫液中無游離酶；

（4）在固定了肝素酶Ⅲ的殼聚糖微球中加入NaBH₄1-5mg/ml，反應1-3h，反應完畢后，以50mM?Tris-HCl（pH?7.0，含10mM?CaCl₂）為緩沖液，對殼聚糖微球進行洗滌，所用緩沖液體積是殼聚糖微球體積的3-5倍，除去殘余的還原劑，由此得到固定在殼聚糖微球上的肝素酶Ⅲ。