[發明專利]一種磷酸化芳香化酶的特異性抗體

在審

• 申請號: 201210422626.2
• 申請日: 2012-10-29
• 公開（公告）號: CN103788210A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 崔玉坤;周克湘;孔麗;陳熹鵬;吳曉;彭志蘭
• 申請（專利權）人: 汕頭大學醫學院
• 主分類號: C07K16/40
• 分類號: C07K16/40;C07K16/06;G01N33/573;G01N33/543
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 戴建波

技術領域

本發明涉及生物醫學領域，具體涉及一種磷酸化芳香化酶的特異性抗體及試劑盒。

背景技術

乳腺癌是全球最常見的女性惡性腫瘤。實驗室及臨床數據均證實，約三分之二的乳腺腫瘤是雌激素受體(ER)陽性的。這部分乳腺癌的形成和進展與雌激素有關(1)。雌激素對乳腺腫瘤的作用是通過雌激素受體(ER)來調節的。以三苯氧胺(TAM)和芳香化酶抑制劑(aromatase?inhibitors，AI)為主的靶向ER的內分泌治療是治療ERα陽性乳腺癌的最常用的方法之一(2-5)。作為絕經后婦女體內雌激素合成系統的限速酶，芳香化酶(aromatase)是乳腺癌治療的一個重要的靶點。近期的臨床研究數據表明，芳香化酶抑制(aromataseinhibitors，AI)單獨使用或與三苯氧胺聯合治療可以進一步改善疾病(3-4)，但是有一部分ER陽性患者在一開始即對此治療不敏感，而多數在治療初期有效的患者最終還是不可避免的會出現耐藥性。如何預測其抑制劑(aromataseinhibitors，AI)耐藥性的發生則成為臨床中重要的問題之一。

芳香化酶(aromatase)是利用睪酮合成雌激素的限速酶(7-8)，其表達是組織特異性的(9)。女性在絕經前的雌激素主要通過卵巢合成，由于增高的卵泡刺激激素作用，AI的治療是無效的。絕經后的雌激素主要由外周組織，包括乳房合成(8)。因此AI主要應用于絕經后的患者(7)。

已有研究發現芳香化酶可以被雌激素激活的c-src激酶所磷酸化，(10)磷酸化位點是第361位的酪氨酸(Y)。另外研究表明，c-src激酶的抑制劑AZ0530可逆轉乳腺細胞對AI的耐藥，而AI本身可以激活c-src激酶(11)。這些結果提示c-src激酶對芳香化酶的磷酸化可能是AI發生的原因，而芳香化酶第361位的酪氨酸的磷酸化則可能是可用于指示AI耐藥發生的一個標志物。我們通過序列分析，發現Y361存在于一個潛在的PI3K的結合位點YXXM(Y=酪氨酸，M=甲硫氨酸，X=任意氨基酸)中(12)，我們前期工作表明芳香化酶在細胞內可以和PI3K調節亞基P85結合，而抑制c-src的活性則可以阻斷這種結合，提示芳香化酶的Y361確實存在于一個PI3K的結合位點中。因此我們推測芳香化酶Y361的磷酸化可以引發與PI3K的結合而介導PI3K活化，從而導致AI耐藥發生，而芳香化酶Y361的磷酸化水平則可用于預測乳癌組織對AI的敏感性。而本技術則正是研發了此特異識別Y361磷酸化芳香化酶的抗體。

發明內容

有鑒于此，本發明的所解決的技術問題在于提供一種磷酸化芳香化酶的特異性抗體，用以檢測Tyr361位點磷酸化的芳香化酶(pY361芳香化酶)的表達情況，以預測和研究芳香化酶抑制劑的耐藥性。

另外，本發明所解決的技術問題還在于提供一種檢測磷酸化芳香化酶抗體的試劑盒，以便檢測pY361芳香化酶抗體的效價。

本發明通過下列技術方案解決上述技術問題：

一種磷酸化芳香化酶的特異性抗體，所述抗體是針對Tyr361位點磷酸化的芳香化酶的特異性抗體。

優選地，所述抗體制備時采用針對芳香化酶中Tyr361磷酸化位點設計的抗原多肽，該抗原多肽的具體序列為：VMENPIPpYSMRY，該序列中pY為磷酸化的氨基酸。

優選地，所述抗原多肽N-端被乙酰基化以維持其穩定性，該抗原多肽偶聯于載體蛋白KLH上。

優選地，所述磷酸化芳香化酶的特異性抗體通過以下方法獲得：通過人工合成所述抗原多肽后，采用偶聯劑將抗原多肽偶聯到載體蛋白KLH上，形成適合動物免疫的KLH-多肽抗原系統，然后經動物免疫產生磷酸化芳香化酶的特異性抗體；再經過抗血清制備和抗體分離純化，最終獲得抗Tyr361位點磷酸化芳香化酶的特異性抗體。

ELISA測試表明：本發明的磷酸化芳香化酶特異性抗體，對Tyr361位點磷酸化芳香化酶具有高度的結合專一性，而與此位點非磷酸化的芳香化酶結合力極低。

更優更具體地說，所述磷酸化芳香化酶的特異性抗體，是采用如下方法獲得的抗體：

(1)抗原多肽的設計與合成：依據蛋白質數據庫中芳香化酶的序列信息，設計出對應芳香化酶的Tyr361磷酸化氨基酸位點兩側一段連續的抗原多肽；并將抗原多肽N-端被乙酰基化以維持其穩定性，抗原多肽的具體序列為VMENPIPpYSMRY，該序列中pY為磷酸化的氨基酸；

(2)通過人工合成Tyr361位點磷酸化的所述抗原多肽后，同時合成與抗原多肽相同序列的但Tyr361位點未磷酸化的陰性抗原多肽；