[發明專利]一種磷酸化芳香化酶的特異性抗體

在審

• 申請號: 201210422626.2
• 申請日: 2012-10-29
• 公開（公告）號: CN103788210A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 崔玉坤;周克湘;孔麗;陳熹鵬;吳曉;彭志蘭
• 申請（專利權）人: 汕頭大學醫學院
• 主分類號: C07K16/40
• 分類號: C07K16/40;C07K16/06;G01N33/573;G01N33/543
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 戴建波

1.一種磷酸化芳香化酶的特異性抗體，其特征在于，所述抗體是針對Tyr361位點磷酸化的芳香化酶的特異性抗體。

2.根據權利要求1所述的磷酸化芳香化酶的特異性抗體，其特征在于，所述抗體制備時采用針對芳香化酶中Tyr361磷酸化位點設計的抗原多肽，該抗原多肽的具體序列為：VMENPIPpYSMRY，該序列中pY為磷酸化的氨基酸。

3.根據權利要求2所述的磷酸化芳香化酶的特異性抗體，其特征在于，所述抗原多肽N-端被乙?；跃S持其穩定性，該抗原多肽偶聯于載體蛋白KLH上。

4.根據權利要求3所述的磷酸化芳香化酶的特異性抗體，其特征在于，所述磷酸化芳香化酶的特異性抗體通過以下方法獲得：通過人工合成所述抗原多肽后，采用偶聯劑將抗原多肽偶聯到載體蛋白KLH上，形成適合動物免疫的KLH-多肽抗原系統，然后經動物免疫產生磷酸化芳香化酶的特異性抗體；再經過抗血清制備和抗體分離純化，最終獲得抗Tyr361位點磷酸化芳香化酶的特異性抗體。

5.根據權利要求3所述的磷酸化芳香化酶的特異性抗體，其特征在于，所述磷酸化芳香化酶的特異性抗體，是采用如下方法獲得的抗體：

(1)抗原多肽的設計與合成：依據蛋白質數據庫中芳香化酶的序列信息，設計出對應芳香化酶的Tyr361磷酸化氨基酸位點兩側一段連續的抗原多肽；并將抗原多肽N-端被乙?；跃S持其穩定性，抗原多肽的具體序列為VMENPIPpYSMRY，該序列中pY為磷酸化的氨基酸；

(2)通過人工合成Tyr361位點磷酸化的所述抗原多肽后，同時合成與抗原多肽相同序列的但Tyr361位點未磷酸化的陰性抗原多肽；

(3)通過偶聯劑將抗原多肽偶聯到載體蛋白KLH上，形成適合動物免疫的KLH-多肽抗原系統；另外，將所述抗原多肽和陰性抗原多肽分別偶聯到載體BSA上，用做ELISA檢測時用的包被抗原；

(4)動物免疫與陽性血清的采集：

免疫之前將偶聯到載體蛋白KLH上的多肽用生理鹽水稀釋成0.25mg/ml；而后每只兔子按照表1中的方案進行免疫：

第一次注射1mg多肽，注射時用等體積的弗氏佐劑充分乳化，經背部皮下多點注射。以后每次免疫量為0.75mg，注射時用不完全弗氏佐劑將抗原也充分乳化，經背部皮下多點注射；

陽性血清采取：兔子免疫兩次之后開始，兔子饑餓24h后，經耳緣靜脈或者髂內靜脈取血，約3-5ml左右；

(5)取血后，37℃下，在不加抗凝劑的條件下讓血液凝固1到2小時；當血清自然析出后，取上清液4℃，12000轉/分，離心10分鐘，分離血清，棄去不溶物；將血清移至一干凈試管，并分裝成小份，不加防腐劑儲藏在-20℃冰箱中。

6.一種檢測磷酸化芳香化酶抗體的試劑盒，包括抗體檢測板和ELISA反應液，其特征在于，所述檢測試劑盒中還包括包被抗體檢測板的包被抗原，所述抗原為針對芳香化酶中Tyr361磷酸化位點設計的抗原多肽。

7.根據權利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述抗原多肽的具體序列為：VMENPIPpYSMRY，該序列中pY為磷酸化的氨基酸。

8.根據權利要求7所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述抗原多肽N-端被乙?；跃S持其穩定性，該抗原多肽偶聯于載體蛋白KLH上。

9.根據權利要求7所述的檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒中ELISA反應液包括：酶結合物工作液，陽性對照，陰性對照，樣品稀釋液，濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液，酶結合物工作液，陽性對照包括磷酸化芳香化酶特異性抗體標準品和非磷酸化芳香化酶特異性抗體標準品，陰性對照為無芳香化酶特異性抗體的陰性血清，所述酶結合物工作液為辣根過氧化物酶標記的抗人IgG。

10.一種權利要求1所述的磷酸化芳香化酶的特異性抗體在制備測定Tyr361位點磷酸化芳香化酶的試劑盒中的應用。