[發(fā)明專利]一種磷酸化芳香化酶的特異性抗體

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201210422626.2
• 申請日: 2012-10-29
• 公開（公告）號: CN103788210A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 崔玉坤;周克湘;孔麗;陳熹鵬;吳曉;彭志蘭
• 申請（專利權(quán)）人: 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院
• 主分類號: C07K16/40
• 分類號: C07K16/40;C07K16/06;G01N33/573;G01N33/543
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司 44202
• 代理人: 戴建波

1.一種磷酸化芳香化酶的特異性抗體，其特征在于，所述抗體是針對Tyr361位點磷酸化的芳香化酶的特異性抗體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷酸化芳香化酶的特異性抗體，其特征在于，所述抗體制備時采用針對芳香化酶中Tyr361磷酸化位點設(shè)計的抗原多肽，該抗原多肽的具體序列為：VMENPIPpYSMRY，該序列中pY為磷酸化的氨基酸。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的磷酸化芳香化酶的特異性抗體，其特征在于，所述抗原多肽N-端被乙酰基化以維持其穩(wěn)定性，該抗原多肽偶聯(lián)于載體蛋白KLH上。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的磷酸化芳香化酶的特異性抗體，其特征在于，所述磷酸化芳香化酶的特異性抗體通過以下方法獲得：通過人工合成所述抗原多肽后，采用偶聯(lián)劑將抗原多肽偶聯(lián)到載體蛋白KLH上，形成適合動物免疫的KLH-多肽抗原系統(tǒng)，然后經(jīng)動物免疫產(chǎn)生磷酸化芳香化酶的特異性抗體；再經(jīng)過抗血清制備和抗體分離純化，最終獲得抗Tyr361位點磷酸化芳香化酶的特異性抗體。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的磷酸化芳香化酶的特異性抗體，其特征在于，所述磷酸化芳香化酶的特異性抗體，是采用如下方法獲得的抗體：

(1)抗原多肽的設(shè)計與合成：依據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中芳香化酶的序列信息，設(shè)計出對應(yīng)芳香化酶的Tyr361磷酸化氨基酸位點兩側(cè)一段連續(xù)的抗原多肽；并將抗原多肽N-端被乙酰基化以維持其穩(wěn)定性，抗原多肽的具體序列為VMENPIPpYSMRY，該序列中pY為磷酸化的氨基酸；

(2)通過人工合成Tyr361位點磷酸化的所述抗原多肽后，同時合成與抗原多肽相同序列的但Tyr361位點未磷酸化的陰性抗原多肽；

(3)通過偶聯(lián)劑將抗原多肽偶聯(lián)到載體蛋白KLH上，形成適合動物免疫的KLH-多肽抗原系統(tǒng)；另外，將所述抗原多肽和陰性抗原多肽分別偶聯(lián)到載體BSA上，用做ELISA檢測時用的包被抗原；

(4)動物免疫與陽性血清的采集：

免疫之前將偶聯(lián)到載體蛋白KLH上的多肽用生理鹽水稀釋成0.25mg/ml；而后每只兔子按照表1中的方案進(jìn)行免疫：

第一次注射1mg多肽，注射時用等體積的弗氏佐劑充分乳化，經(jīng)背部皮下多點注射。以后每次免疫量為0.75mg，注射時用不完全弗氏佐劑將抗原也充分乳化，經(jīng)背部皮下多點注射；

陽性血清采取：兔子免疫兩次之后開始，兔子饑餓24h后，經(jīng)耳緣靜脈或者髂內(nèi)靜脈取血，約3-5ml左右；

(5)取血后，37℃下，在不加抗凝劑的條件下讓血液凝固1到2小時；當(dāng)血清自然析出后，取上清液4℃，12000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，分離血清，棄去不溶物；將血清移至一干凈試管，并分裝成小份，不加防腐劑儲藏在-20℃冰箱中。

6.一種檢測磷酸化芳香化酶抗體的試劑盒，包括抗體檢測板和ELISA反應(yīng)液，其特征在于，所述檢測試劑盒中還包括包被抗體檢測板的包被抗原，所述抗原為針對芳香化酶中Tyr361磷酸化位點設(shè)計的抗原多肽。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述抗原多肽的具體序列為：VMENPIPpYSMRY，該序列中pY為磷酸化的氨基酸。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述抗原多肽N-端被乙酰基化以維持其穩(wěn)定性，該抗原多肽偶聯(lián)于載體蛋白KLH上。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒中ELISA反應(yīng)液包括：酶結(jié)合物工作液，陽性對照，陰性對照，樣品稀釋液，濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液，酶結(jié)合物工作液，陽性對照包括磷酸化芳香化酶特異性抗體標(biāo)準(zhǔn)品和非磷酸化芳香化酶特異性抗體標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對照為無芳香化酶特異性抗體的陰性血清，所述酶結(jié)合物工作液為辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG。

10.一種權(quán)利要求1所述的磷酸化芳香化酶的特異性抗體在制備測定Tyr361位點磷酸化芳香化酶的試劑盒中的應(yīng)用。