[發明專利]一種α1-蛋白酶抑制劑的制備方法

有效

• 申請號: 201210421389.8
• 申請日: 2012-10-29
• 公開（公告）號: CN103788209A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 李海;黃榮強;李振江
• 申請（專利權）人: 廣東雙林生物制藥有限公司
• 主分類號: C07K14/81
• 分類號: C07K14/81;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/20;C07K1/16
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 劉菁菁

技術領域

本發明涉及一種α1-蛋白酶抑制劑的制備方法。

背景技術

先天性α1-抗胰蛋白酶缺乏癥是世界范圍內最常見的致死性遺傳性疾病之一，以血清α1-蛋白酶抑制劑水平下降為特征，α1-蛋白酶抑制劑缺乏嚴重者的個體血漿中的α1-蛋白酶抑制劑濃度僅為正常人的15-20％，由于失去了α1-蛋白酶抑制劑的保護，肺泡結構中的彈性蛋白酶進行性破壞，從而使患者早年發生肺氣腫的危險性增加。α1-蛋白酶抑制劑作為20世紀80年代才出現的一種人血漿制品，主要用于因先天性α1-抗胰蛋白酶缺乏引起的肺氣腫患者的終身替補治療和肺部炎癥性疾病的防治，如慢性阻塞性肺氣腫、肺囊性纖維化、急性肺損傷、成人呼吸窘迫綜合癥等。它還能與抗凝血酶III聯合使用，治療彌漫性血管內凝血，在臨床上有廣泛的應用前景。

1988年α1-蛋白酶抑制劑替代治療方法矯正α1-抗胰蛋白酶缺乏癥獲得美國衛生機構批準，多年的臨床應用結果表明：對先天性α1-抗胰蛋白酶缺乏性肺氣腫患者每周注射60mg/kg的α1-蛋白酶抑制劑進行補充治療，對肺氣腫的突發有良好的治療與預防效果，患者長期使用α1-蛋白酶抑制劑后無副作用，這說明先天性α1-抗胰蛋白酶缺乏的替代療法已被證實，而且效果良好，具有較好的市場潛力。自1987年Bayer公司生產的α1-蛋白酶抑制劑Prolastin獲準上市以來，已有四家公司的制品取得了美國FDA的上市批準。公開日為2011.06.15，公開號為CN102099369A的PCT申請《制備α1-蛋白酶抑制劑的方法》公開了一種用疏水作用色譜法（HIC）自包含α1-蛋白酶抑制劑的溶液中純化其的辦法，該方法提供了一種更高的回收率，純度和病原清除率。

由于α1-蛋白酶抑制劑基本上來源于人血漿，原料來源有限，所以需要一種成本低，同時可以更充分利用血漿的制造方法，來最大限度的滿足臨床病人的需求和最大可能的提高血漿利用率。

發明內容

本發明的目的是要提供一種低成本，可提高血漿利用率的α1-蛋白酶抑制劑制造方法。為實現此目的，本發明采用以下技術方案。

一種制備α1-蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于包含以下步驟：

（1）稱取組分IV沉淀，加入3-6倍（重量體積比）的注射用水，控制pH值在5.0-6.0之間，18-25℃攪拌0.5-1.5小時，固液分離，棄上清液；所述組份IV沉淀為低溫乙醇分離法分離血漿蛋白產生的廢棄組分。

（2）收集步驟（1）所得沉淀，加入8-12倍（重量體積比）注射用水，加入終濃度為0.02M-0.08M的Tris堿粉、終濃度為0.005M-0.015M的氯化鈉，得到反應液，控制反應液的pH值在9.0-9.5之間，18-25℃下攪拌1-3小時；

（3）向步驟（2）所得反應液中加入終濃度為10％-15％的PEG4000，調整pH值在4.8-5.6之間，18-25℃攪拌0.5-1.5小時，固液分離，取上清液；

（4）向步驟（3）所得上清液中加入氯化鋅溶液，至氯化鋅在上清液中的終濃度為0.005-0.010M，用氫氧化鈉調pH值至7.0-8.0，18-25℃攪拌1-3小時，固液分離，取氯化鋅沉淀；

（5）將步驟（4）所得氯化鋅沉淀，用濃度為0.01-0.02M、pH值在6.5-7.0之間，含有濃度為0.01M?EDTA的磷酸鹽緩沖液溶解后，上樣，進行羥基磷灰石柱層析：首先用濃度為0.01-0.02M、pH值在6.5-7.0之間的磷酸鹽緩沖液進行洗滌，然后再用濃度為0.04-0.10M、pH值在6.5-7.0之間的磷酸鹽緩沖液進行洗脫，并收集羥基磷灰石層析洗脫液；

（6）在羥基磷灰石層析洗脫液中加入硫酸銨，至終濃度為0.8-1.2M后，將其通過苯基瓊脂糖凝膠疏水層析柱，再用濃度為0.04-0.10M、pH值在6.5-7.0之間，含濃度為0.8-1.2M的硫酸銨的磷酸鹽緩沖液洗滌，并收集穿透峰；

（7）將疏水層析穿透峰收集液用10Kd分子截留量的膜包超濾濃縮至蛋白含量1-2％，加入保護劑，進行巴氏消毒（60℃孵育10小時），所述保護劑為鹽、糖、氨基酸或其混合物；

（8）再次超濾去除保護劑，濃縮至蛋白含量2-5％，加入凍干賦形劑及穩定劑，除菌過濾，分裝，凍干，得到α1-蛋白酶抑制劑成品。

進一步的，所述步驟（1）控制pH值范圍在5.0-6.0之間，優選為5.8。

進一步的，所述步驟（3）的pH值范圍在4.8-5.6之間，優選為5.2。