[發明專利]一種α1-蛋白酶抑制劑的制備方法

有效

• 申請號: 201210421389.8
• 申請日: 2012-10-29
• 公開（公告）號: CN103788209A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 李海;黃榮強;李振江
• 申請（專利權）人: 廣東雙林生物制藥有限公司
• 主分類號: C07K14/81
• 分類號: C07K14/81;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/20;C07K1/16
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 劉菁菁

1.一種制備α1-蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于包含以下步驟：

（1）稱取組份IV沉淀，加入3-6倍重量體積比的注射用水，控制pH值在5.0-6.0之間，18-25℃攪拌0.5-1.5小時，固液分離，棄上清液；所述組份IV沉淀為低溫乙醇分離法分離血漿蛋白產生的廢棄組分。

（2）收集步驟（1）所得沉淀，加入8-12倍重量體積比注射用水，加入終濃度為0.02M-0.08M的Tris堿粉、終濃度為0.005M-0.015M的氯化鈉，得到反應液，控制反應液的pH值在9.0-9.5之間，18-25℃下攪拌1-3小時；

（3）向步驟（2）所得反應液中加入終濃度為10％-15％的PEG4000，調整pH值在4.8-5.6之間，18-25℃攪拌0.5-1.5小時，固液分離，取上清液；

（4）向步驟（3）所得上清液中加入氯化鋅溶液，至氯化鋅在上清液中的終濃度為0.005-0.010M，用氫氧化鈉調pH值至7.0-8.0，18-25℃攪拌1-3小時，固液分離，取氯化鋅沉淀；

（5）將步驟（4）所得氯化鋅沉淀，用濃度為0.01-0.02M、pH值在6.5-7.0之間，并且含有濃度為0.01M?EDTA的磷酸鹽緩沖液溶解后，上樣，進行羥基磷灰石柱層析：首先用濃度為0.01-0.02M、pH值在6.5-7.0之間的磷酸鹽緩沖液進行洗滌，然后再用濃度為0.04-0.10M、pH值在6.5-7.0之間的磷酸鹽緩沖液進行洗脫，并收集羥基磷灰石層析洗脫液；

（6）在羥基磷灰石層析洗脫液中加入硫酸銨，至終濃度為0.8-1.2M后，將其通過苯基瓊脂糖凝膠疏水層析柱，再用濃度為0.04-0.10M、pH值在6.5-7.0之間，含質量為0.8-1.2M的硫酸銨的磷酸鹽緩沖液洗滌，收集穿透峰；

（7）將疏水層析穿透峰收集液用10Kd分子截留量的膜包超濾濃縮至蛋白含量1-2％，加入保護劑，進行巴氏消毒（60℃孵育10小時），所述保護劑為鹽、糖、氨基酸或其混合物；

（8）再次超濾去除保護劑，濃縮至蛋白含量2-5％，加入凍干賦形劑及穩定劑，除菌過濾，分裝，凍干，得到α1-蛋白酶抑制劑成品。

2.如權利要求1所述的一種制備α1-蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于所述步驟（1）控制pH值范圍在5.0-6.0之間，優選為5.8。

3.如權利要求1所述的一種制備α1-蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于所述步驟（3）的pH值范圍在4.8-5.6之間，優選為5.2。

4.如權利要求1所述的一種制備α1-蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于所述步驟（4）中氯化鋅在上清液的終濃度為0.005-0.010M，優選終濃度為0.006M。

5.如權利要求1所述的一種制備α1-蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于所述步驟（5）中羥基磷灰石柱層析所用的吸附介質為羥基磷灰石，優選使用Macro-Prep?Ceramic?Hydroxyapatite?Type?I。

6.如權利要求1所述的一種制備α1-蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于所述步驟（5）中羥基磷灰石層析柱的平衡液為濃度為0.01M-0.02M、pH值在6.5-7.0之間的磷酸鹽緩沖液，優選為濃度0.02M、pH值6.8的磷酸鹽緩沖液。

7.如權利要求1所述的一種制備α1-蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于所述步驟（6）中的疏水層析柱介質為苯基瓊脂糖凝膠，優選使用Phenyl-Sepharose?6Fast?Flow?HS。

8.如權利要求1所述的一種制備α1-蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于所述步驟（6）中的疏水層析柱的平衡液為濃度為0.04-0.10M、pH值在6.5-7.0之間，含濃度為0.8-1.2M硫酸銨的磷酸鹽緩沖液，優選為濃度為0.1M、pH值為6.8，含濃度為1M的硫酸銨的磷酸鹽緩沖液。

9.如權利要求1所述的一種制備α1-蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于所述步驟（7）中巴氏消毒的保護劑為蔗糖和乙酸鉀混合保護劑，蔗糖含量控制在40％-60％，乙酸鉀含量控制在4％-6％。