[發(fā)明專利]達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株及制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210420714.9
• 申請(qǐng)日: 2012-10-29
• 公開（公告）號(hào): CN102965304A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁淑芳;李國(guó)順;馬雯;李蓉暉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12N13/00;C12N15/01;C07K7/08;C07K1/18;C07K1/16;C12R1/465
• 代理公司: 成都虹橋?qū)＠聞?wù)所(普通合伙) 51124
• 代理人: 梁鑫

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株及其制備方法。

背景技術(shù)

抗耐藥菌藥物是目前世界上藥物研究開發(fā)的重點(diǎn)和發(fā)展方向之一。達(dá)托霉素(Daptomycin，DAP)是近年第一個(gè)環(huán)脂肽類新型抗生素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同于已有所有類別的抗生素,是近四十年來繼噁唑烷酮類抗生素后,應(yīng)用到臨床的唯一新結(jié)構(gòu)類別抗生素。達(dá)托霉素最初是由Lilly公司80年代末研究獲得，于1997年11月將DAP的全球獨(dú)家開發(fā)、生產(chǎn)銷售權(quán)轉(zhuǎn)讓給Cubist制藥公司開發(fā)的環(huán)脂肽類抗生素。2003年底，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)經(jīng)過快速審理程序批準(zhǔn)注射用達(dá)托霉素(商品名Cubicin)用于治療金黃色葡萄球菌(包括耐甲氧西林菌株)、化膿性念球菌、無乳念球菌、停乳念球菌似馬亞種和糞腸球菌(萬古霉素敏感菌株)引起的復(fù)雜性皮膚及皮膚組織感染(cSSSI)。隨后也批準(zhǔn)用于治療金黃色葡萄球菌引起的菌血癥(SAB)，包括甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌(MSSA)和耐甲氧西林性金黃色葡萄球菌(MRSA)引起的右側(cè)感染性心內(nèi)膜炎(RIE)。注射用達(dá)托霉素除2003年在美國(guó)上市外，還分別于2006年在奧地利、德國(guó)、荷蘭、西班牙、英國(guó)和2007年在瑞士上市。由于作用機(jī)制和結(jié)構(gòu)上的差異，達(dá)托霉素在臨床上有著明顯的優(yōu)勢(shì)，其前景非常可觀。達(dá)托霉素在2007年院區(qū)感染治療藥物市場(chǎng)上的銷售額達(dá)到2億美元，在以后數(shù)年內(nèi)還有上升的潛力。

隨著高致病耐藥菌,如耐甲氧西林金葡菌(MRSA)、耐萬古霉素腸球菌(VRE)和耐青霉素肺炎鏈球菌(PRSP)等的不斷出現(xiàn),臨床上對(duì)新抗生素的需求變得十分迫切。達(dá)托霉素除了能作用于大多數(shù)臨床相關(guān)革蘭氏陽(yáng)性菌外，對(duì)以上耐藥菌均有很好的殺菌效果,毒副作用小。它的上市為臨床醫(yī)生提供了一種新的治療方案。

迄今，我國(guó)還沒有研發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的達(dá)托霉素藥品，只是在2009年進(jìn)口Cubist公司的產(chǎn)品。國(guó)內(nèi)中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所和上海吉爾生化有限公司有機(jī)合成達(dá)托霉素獲得成功（專利申請(qǐng)?zhí)?00710037006.6），但其合成工藝復(fù)雜、產(chǎn)品得率低，生產(chǎn)成本較高，不適宜達(dá)托霉素的工業(yè)化生產(chǎn)。而以Streptomyces?lividans為宿主構(gòu)建基因工程菌,進(jìn)行達(dá)托霉素的異源表達(dá)，表達(dá)水平(22mg/L)遠(yuǎn)低于原菌株。進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基中磷酸鹽水平,刪除產(chǎn)放線菌素的act基因簇以減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷,提高外源基因表達(dá)水平,達(dá)托霉素產(chǎn)量最終可以達(dá)到55mg/L。由于受表達(dá)水平的制約,利用Streptomyces?lividans進(jìn)行達(dá)托霉素的異源表達(dá)目前僅停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段。達(dá)托霉素異源表達(dá)水平距產(chǎn)業(yè)化要求尚有較大差距（Julia?P,Xiang?L,Whiting?A,et?al.Heterologous?production?of?daptomycin?in?streptomyces?lividans.Journal?of?Industrial?Microbiology?&?Biotechnology,2006,33(2):121-128.）。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是目前達(dá)托霉素產(chǎn)量低，難以獲得的技術(shù)問題。本發(fā)明采用的解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案為提供一種玫瑰孢鏈霉菌Streptomyces?roseosporus的突變株，命名為Streptomyces?roseosporus?SCU。

本發(fā)明玫瑰孢鏈霉菌Streptomyces?roseosporus的突變株是由申請(qǐng)人四川大學(xué)以玫瑰孢鏈霉菌（Streptomyces?roseosporus）NRRL?11379株為出發(fā)菌株誘變得到，該突變株已于2012年07月12日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101）保藏，分類命名為玫瑰孢鏈霉菌Streptomyces?roseosporus，保藏號(hào)為CGMCC?No.6356。

其中，上述玫瑰孢鏈霉菌突變株Streptomyces?roseosporus?SCU：具有高的達(dá)托霉素產(chǎn)量。

本發(fā)明還提供了一種制備上述的突變株Streptomyces?roseosporus?SCU的方法。該方法包括以下步驟：

1）、對(duì)野生型玫瑰孢鏈霉菌（Streptomyces?roseosporus）進(jìn)行EMS/紫外復(fù)合誘變處理，涂布斜面，培養(yǎng)，得誘變處理突變株；