[發明專利]狂犬病毒糖蛋白與核蛋白的抗原表位多肽及其篩選、鑒定方法與應用

無效

• 申請號: 201210418662.1
• 申請日: 2012-10-29
• 公開（公告）號: CN102924571A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 朱乃碩;胡曉波
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K7/08;C12N15/47;C12N15/63;C07K19/00;C12Q1/02;A61K39/205;A61P31/14;G01N33/68
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;盛志范

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種狂犬病毒糖蛋白與核蛋白抗原表位及其篩選、鑒定方法與應用。

背景技術

狂犬病是當前威脅人類健康的一種比較嚴重的急性傳染病，人類患者一旦被病畜咬傷而發病，死亡率高達95%以上。狂犬病病毒屬于彈狀病毒科(rhabdoviridae)，狂犬病病毒屬(lyssa?virus)，呈子彈狀。狂犬病病毒可通過破損的皮膚或黏膜侵入人體，經神經末梢上行進入人及所有溫血動物中樞神經系統(CNS)而引發狂犬病。狂犬病病毒基因組核酸為不分節段的單股負鏈RNA，由11928或11932個核苷酸組成，相對分子量約4.6×10⁶，3’到5’端依次排列著N、?P、M、G、L基因，分別編碼5種結構蛋白：核蛋白(nucleoprotein,?NP)、磷酸化蛋白(phosphoprotein，PP)、基質蛋白(matrix?protein,?MP)、糖蛋白(glycoprotein，GP)和轉錄酶大蛋白(large?protein,?LP)。完整的狂犬病病毒顆粒由核衣殼和包膜兩部分構成，核衣殼由核蛋白、磷蛋白和轉錄酶大蛋白構成，而包膜由糖蛋白和基質蛋白構成。

當前我國狂犬病形勢相當嚴峻，發病率居世界第二位，僅次于印度。通過注射狂犬病毒疫苗預防狂犬病的感染是當前控制狂犬病發病的重要途徑。但是目前狂犬病毒疫苗的免疫效果在人群中存在較大差異，且注射后體內狂犬病毒抗體的滴度上升到具有保護效力的滴度所需要的時間較長，不足以在病毒潛伏期內產生足夠的抗體以抵抗狂犬病毒的感染和發病。

表位疫苗作為近年來新發展起來的一種新型疫苗技術，其含有能夠被機體免疫細胞直接識別的MHC限制性多肽，能夠激發機體產生廣泛而強烈的細胞免疫與體液免疫反應，特別是針對T細胞表位設計的表位疫苗，能夠產生具有細胞殺傷作用的CTL和促進中和抗體產生的Th免疫應答反應，對于清除病毒感染、提供免疫保護具有重要的作用。

發明內容

本發明的目的是提供一種狂犬病毒的抗原表位多肽，并提供篩選和鑒定這種表位多肽的方法以及抗原表位多肽的應用。

本發明涉及的一系列狂犬病毒抗原表位多肽，具體包含以下序列：

（1）狂犬病毒糖蛋白氨基酸序列第367~381的Th表位，記作G_367-381，以及第333~341的CTL表位，記作G_333-341，分別如SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2所示；

（2）狂犬病毒核蛋白氨基酸序列第92~106的Th表位，記作N_92-106，以及第409~423的CTL表位，記作N_409-423，分別如SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4所示。

本發明提供的狂犬病毒糖蛋白與核蛋白的抗原表位多肽，具有MHC限制性的特征，并且所述抗原為如下(a)或?(b)所示的蛋白質：

?(a)?由SEQ.ID?.NO.1、SEQ.ID?.NO.2、SEQ.ID?.NO.3或SEQ.ID?.NO.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

?(b)?在(a)中的氨基酸經過取代、缺失或添加1~5個氨基酸且具有狂犬病抗原表位活性的由(a)衍生的蛋白質。

本發明還提供編碼所述蛋白質(a)或?(b)的基因，其具有：

?(a)?由SEQ.ID?.NO.1、SEQ.ID?.NO.2、SEQ.ID?.NO.3或SEQ.ID?.NO.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

?(b)?在?(a)中的氨基酸經過取代、缺失或添加1~5個氨基酸且具有狂犬病抗原表位活性的由?(a)衍生的蛋白質。

本發明還提供所述基因的原核表達載體。

本發明還提供所述的狂犬病毒糖蛋白與核蛋白的抗原表位多肽，其由上述4條多肽以任意順序直接連接或者通過連接肽連接而成。

本發明提供的一系列狂犬病毒抗原表位多肽具有以下的功能特征：①在淋巴細胞增殖實驗中，可刺激經疫苗免疫的BALB/c小鼠脾細胞增殖，刺激指數SI＞2；②在ELISPOT實驗中，可刺激經疫苗免疫的BALB/c小鼠脾細胞分泌細胞因子IL-4和IFN-γ；????????????????????????????????????????????????在流式細胞實驗中，可誘導CD3^+?CD4^+?T細胞和CD3^+?CD8^+?T細胞分化。

本發明公開的篩選和鑒定表位多肽的方法，具體步驟為：