[發明專利]一種原生質體轉化選育高產亮氨酸氨肽酶菌株的方法

無效

• 申請號: 201210418605.3
• 申請日: 2012-10-29
• 公開（公告）號: CN102876705A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 田亞平;汪曉東;高新星
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N1/21;C12N9/48;C12R1/125
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一種原生質體轉化選育高產亮氨酸氨肽酶菌株的方法，其特征在于：

（1）轉化：利用原生質體轉化技術，將8×10⁹個/mL的枯草芽孢桿菌Zj016原生質體懸液500?μL，依次加入20?μL?0.1μg/μL的質粒PMA-BSAP及20?μL的高滲緩沖液SMM，用槍頭輕輕吹吸混勻；再加入1.5?mL融合劑，輕輕顛倒混勻后，37℃、80r/min處理5min，2000?r/min離心10?min；用SMM洗滌2次后重懸；

所述高滲緩沖液SMM以mol/L計為：蔗糖0.5，順丁烯二酸0.02，MgCl_2?0.02，用去離子水配制，調pH為7.0；

所述融合劑為：40%?PEG6000，用SMM液配制，調pH為7.0；

（2）再生：將步驟（1）所得重懸液稀釋涂布于轉化子再生培養基中，37℃培養24?h，得轉化子；

所述轉化子再生培養基以g/L計為：蛋白胨?10，牛肉膏?5，酪蛋白氨基酸水解物?5，葡萄糖?6，氯化鈉?1.2，瓊脂?20,卡那霉素?0.05，用SMM溶液配制，pH?7.2；

（3）篩選：挑選步驟（2）所得轉化子劃線涂布于高產菌株篩選培養基，成功選育獲得高產亮氨酸氨肽酶菌株；

所述高產菌株篩選培養基以g/L計為：可溶性淀粉6，豆粕18，酵母膏24，甘油2.5，K₂HPO₄·?3H₂O?6，CoCl_2?0.015，L-亮氨酸-4-硝基苯胺?0.5，卡那霉素?0.05，瓊脂?20，用去離子水配制，pH?8.0。

2.用權利要求1所述原生質體轉化選育高產亮氨酸氨肽酶菌株的方法獲得一株高產亮氨酸氨肽酶的重組轉化菌，該重組轉化菌分類命名為枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）ZH-Zj016，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：CGMCC?No.6559，其產酶酶活力達126?U/mL,產酶水平是出發菌Zj016的18倍，傳代多次實驗證明該重組轉化菌的遺傳性能穩定。

3.用權利要求2所述CGMCC?No.6559菌株發酵產亮氨酸氨肽酶的方法，其特征在于通過單因素實驗對該轉化菌的搖瓶培養基成分及發酵條件初步優化后，在搖瓶培養基成分為：可溶性淀粉6?g/L，豆粕18?g/L，酵母膏24?g/L，甘油2?mL/L，K₂HPO₄·3H₂O?6g/L，CoCl_2?0.6mmol/L，卡那霉素0.05g/L，用去離子水配制；發酵條件為：初始pH?8.0，發酵溫度37℃，接種量4%，裝液量50mL/250mL，往復式搖床225?r/min，發酵30?h條件下，CGMCC?No.6559發酵產亮氨酸氨肽酶酶活為161U/mL，達出發菌株Zj016的23倍。