[發明專利]一種原生質體轉化選育高產亮氨酸氨肽酶菌株的方法

無效

• 申請號: 201210418605.3
• 申請日: 2012-10-29
• 公開（公告）號: CN102876705A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 田亞平;汪曉東;高新星
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N1/21;C12N9/48;C12R1/125
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

原生質體轉化選育高產亮氨酸氨肽酶菌株的方法，具體地說是利用原生質體轉化育種技術將重組質粒PMA-BSAP轉入枯草芽孢桿菌Zj016原生質體，適宜的條件下再生細胞壁，成功獲得一株重組轉化菌ZH-Zj016；傳代多次實驗證明該重組轉化菌的遺傳性能穩定。初步優化該轉化菌的搖瓶培養基成分及發酵條件后，重組轉化菌ZH-Zj016發酵產亮氨酸氨肽酶酶活為161U/mL，達原始菌株Zj016的23倍。屬于酶制劑、食品添加劑技術領域。

背景技術

原生質體轉化技術是20世紀60年代發展起來的一項重要的分子生物學技術，應用原生質體轉化技術進行微生物選育，因為酶解去除了細胞壁，去除了細胞與外源DNA相互接觸和交流的天然屏障，可以打破微生物的種屬界限，實現遠源菌株間的基因重組；且遺傳信息量大，遺傳物質的傳遞更為完整，有利于提高育種速度，從而使得人們能夠在短時間內選育到理想菌株。

微生物菌種是發酵工業的核心，由其代謝產生的酶類已經應用于人們生活的方方面面，蛋白酶就在食品、皮革、洗滌劑等工業生產領域都有重要的應用，酶制劑是發酵產業的核心產品，酶制劑行業推動了發酵工業和相關行業的發展，并產生了巨大的經濟和社會效益。氨肽酶是一類從蛋白質或肽鏈的氮端酶切氨基酸殘基的外肽酶的總稱，其在食品行業、醫學、化工等方面都具有廣泛的應用。國內在氨肽酶生產方面的研究處于快速發展的階段，對于實現產業化，填補國內產品的空白，替代進口產品，增強我國酶制劑行業競爭力，打破該產品被國外的壟斷有著重要的意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用原生質體轉化技術篩選高產亮氨酸氨肽酶菌株的方法，篩選到的高產菌株產酶能力相對出發菌株有顯著提高。

本發明的技術方案：一種原生質體轉化選育高產亮氨酸氨肽酶菌株的方法，對可產亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢桿菌Zj016的原生質體制備及再生條件進行優化，在此基礎上，將重組質粒PMA-BSAP與所制備的枯草芽孢桿菌Zj016的原生質體混合于高滲緩沖液中，在PEG介導下，使原生質體與PMA-BSAP發生相互凝聚，進行遺傳轉化，適宜的條件下再生細胞壁，成功獲得一株重組轉化菌ZH-Zj016，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：CGMCC?No.6559，初步優化該重組轉化菌的搖瓶培養基成分及發酵條件，獲得高產亮氨酸氨肽酶菌株，工藝為：

A.高產亮氨酸氨肽酶菌株篩選：

(1)出發菌株：枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）Zj016（【食品與發酵工業】2006年32卷第3期已公開，本校實驗室保藏，申請日起20年內向公眾提供）；

(2)質粒：重組質粒PMA-BSAP，詳見中國專利CN102492645A；

(3)高滲緩沖液(SMM液)（mol/L）：蔗糖0.5，順丁烯二酸0.02，MgCl_2?0.02，用去離子水配制，調pH為7.0；

(4)融合劑：用SMM液配制質量濃度40%?PEG6000，調pH為7.0；

(5)溶菌酶溶液：用SMM高滲液配制成20?mg/mL，過濾除菌，-20℃保存；

(6)液體培養基(g/L)：蛋白胨?10，氯化鈉?5，牛肉膏?5，用去離子水配制，pH?7.2，121℃滅菌20?min；

(7)固體培養基?(g/L)：蛋白胨?10，氯化鈉?5，牛肉膏?5，瓊脂?20，用去離子水配制，pH?7.2，121℃滅菌20?min；

(8)再生培養基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏5，NaCl?5，瓊脂粉40，用SMM液配制，pH?7.2；

(9)轉化子再生培養基(g/L)：蛋白胨?10，牛肉膏?5，酪蛋白氨基酸水解物?5，葡萄糖?6，氯化鈉?1.2，瓊脂?20,卡那霉素?0.05，用SMM溶液配制，pH?7.2；

(10)高產菌株篩選培養基（g/L）：可溶性淀粉6，豆粕18，酵母膏24，甘油2.5，K₂HPO₄·?3H₂O?6，CoCl_2?0.015，L-亮氨酸-4-硝基苯胺0.5，卡那霉素?0.05，瓊脂?20，用去離子水配制，pH?8.0；

（11）種子培養基(g/L)：蛋白胨10，氯化鈉5，牛肉膏5，用去離子水配制，pH?7.2；