[發(fā)明專利]一種以蕓薹屬植物基因表達的變化來檢測鎘污染的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210416258.0
• 申請日: 2012-10-26
• 公開（公告）號: CN102912023A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 嚴明理;馮濤;向言詞;劉麗莉;柴立元;李夕兵
• 申請（專利權(quán)）人: 中南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 張家界市慧誠商標專利事務所 43209
• 代理人: 高紅旺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學方法檢測環(huán)境污染的技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種以芥菜鎘特異誘導基因的表達變化來檢測鎘污染的方法。

?背景技術(shù)

傳統(tǒng)的環(huán)境中鎘檢測通常采用原子吸收光譜儀檢測，該法需要昂貴的儀器、良好的實驗平臺和較高的費用，不利于在基層環(huán)境檢測單位和用戶中推廣，因此發(fā)明一種快速、簡便、低廉的檢測鎘污染的檢測方法很有必要。

多聚酶鏈式反應（polymerase?chain?reaction，即PCR），是目前最流行的體外擴增DNA片段的技術(shù)，具有快速、敏感和特異性強等特點，如能將該技術(shù)用于鎘相關(guān)基因表達的檢測，將具有重要的意義和廣闊的應用前景。

芥菜和白菜等在分類上都屬于蕓薹屬，基因測序表明蕓薹屬各物種之間基因序列的保守性比較高。有研究表明蕓薹屬植物對鎘有某種耐受或富集機制，鎘處理可以特異誘導相關(guān)基因表達的變化。模式植物擬南芥與蕓薹屬的植物親緣關(guān)系近，我們用擬南芥29K表達芯片與不同濃度鎘處理的蕓薹屬植物芥菜的核酸雜交，發(fā)現(xiàn)了鎘特異誘導的上調(diào)和下調(diào)表達的擬南芥同源基因，因此，在芥菜中克隆這些基因片段，并根據(jù)這些基因的保守區(qū)域設(shè)計引物，可以通過半定量PCR來檢測這些鎘誘導下特異表達基因的變化的情況來評價環(huán)境中的鎘污染程度。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)的鎘污染檢測方法的不足，提供一種快速、特異性好、靈敏度高的檢測鎘污染的方法。本發(fā)明方法使用試劑價格低廉，操作簡單，效果明顯，見效快，以便應用于農(nóng)作物的安全栽培與生產(chǎn)?。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案:?一種以蕓薹屬植物基因表達的變化來檢測鎘污染的方法，其步驟包括：

1?確定鎘誘導下特異表達的上調(diào)基因和下調(diào)基因

選取飽滿、干凈的芥菜種子，用75%乙醇浸泡1?min，然后在0.1%升汞中滅菌10-15?min，無菌水沖洗2-3次，在無菌水中浸泡5-6小時后，用濾紙吸干多余的水分，接種于pH為6.0的?1/2?MS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基含5g/L?蔗糖，0.7?%?瓊脂。鎘（Cd²⁺）濃度水平分別為0mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg和1.5mg/kg，日夜長比為14/10h,?日夜溫為22/16℃，光照強度為200?μmol?m^–2?s^–1。在無菌條件下溫室中生長15天，取固體培養(yǎng)基中的油菜根部進行實驗。

采集鎘處理和對照組的芥菜，進行總RNA的提取，與擬南芥29K表達芯片雜交并進行信號分析，具體操作按常規(guī)的表達譜芯片使用說明進行。根據(jù)雜交信號的分析結(jié)果，找到芥菜鎘誘導下特異表達的擬南芥同源的上調(diào)和下調(diào)基因，再利用同源克隆的方法在芥菜中克隆這些基因片段，以克隆這些基因片段序列為基礎(chǔ)，在NCBI-BLAST中找到基因的保守區(qū)，在保守區(qū)利用軟件Primer?Premier?5.0設(shè)計引物，以Actin基因的表達為參照，其的正向引物ACTF、?ACTF序列為：5'-GACATTCAACCTCTTGTTTGC-3'，反向引物ACTR序列為：5'-?CTGCTCGTAGTCAAGAGCAATG-3'；采用半定量PCR法，重復3次；PCR反應的總體積為10μL，PCR擴增的反應條件按常規(guī)的方法進行。進行PCR擴增溫度如下：先94℃?3min，再94℃,?25s;?60℃,?25s;?72℃,?30?s,?28個循環(huán)后，72℃延長6?min，反應結(jié)束后，得擴增產(chǎn)物。取擴增產(chǎn)物，加1/5倍體積的上樣緩沖液（含溴酚藍），經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳15-30min后在紫外儀上觀察，并利用圖像軟件分析擴增產(chǎn)物的亮度。根據(jù)國家土壤環(huán)境質(zhì)量標準（GB15618-1995）二級標準的臨界值?1.0mg/kg，以平均亮度增加或減弱2倍以上為標準，篩選并確定了芥菜鎘濃度大于1.0mg/kg誘導下特異表達的6個上調(diào)基因和6個下調(diào)基因，以此作為鎘污染檢測的基因。

所述芥菜鎘誘導下特異表達的6個顯著上調(diào)基因的引物（正向引物簡稱F,?反向引物簡稱R）具序列如下：?

UP1：F：5'-?CGGAGTGGCTAAGCTTGTTCG-3'???R:5'-CCACAAGACCAAACATCAGCG-3'???

UP2：F：5'-GCTGTCAAAGCTGGTGAAACC-3'???R:5'-?CCGCAATCCTCAGCTAGAGC-3'?

UP3：F：5'-AAGAGCAAGCCAAGGAAGG-3'????R：5'-GGCACTGTGGGCGAAGTAG-3'