[發明專利]一種以蕓薹屬植物基因表達的變化來檢測鎘污染的方法

無效

• 申請號: 201210416258.0
• 申請日: 2012-10-26
• 公開（公告）號: CN102912023A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發明（設計）人: 嚴明理;馮濤;向言詞;劉麗莉;柴立元;李夕兵
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 張家界市慧誠商標專利事務所 43209
• 代理人: 高紅旺

1.?一種以蕓薹屬植物基因表達的變化來檢測鎘污染的方法，其特征在于，步驟包括:

步驟一：確定鎘誘導下特異表達的上調基因和下調基因，方法如下:

選取飽滿、干凈的芥菜種子，用75%乙醇浸泡1?min，然后在0.1%升汞中滅菌10-15?min，無菌水沖洗2-3次，在無菌水中浸泡5-6小時后，用濾紙吸干多余的水分，接種于1/2?MS固體培養基上，MS固體培養基的pH值為?6.0，其中含5g/L?蔗糖，0.7?%?瓊脂，鎘（Cd²⁺）濃度水平分別為0mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg和1.5mg/kg，日夜長比為14/10h,?日夜溫為22/16℃,光照強度為200?μmol?m^–2?s^–1；在無菌條件下溫室中生長15天，取固體培養基中的油菜根部進行實驗；

采集鎘處理和對照組芥菜的根，進行總RNA的提取，與擬南芥29K表達芯片雜交并進行信號分析；根據雜交信號的分析結果，找到芥菜鎘誘導下特異表達的擬南芥同源的上調和下調基因，再利用同源克隆的方法在芥菜中克隆這些基因片段，以克隆這些基因片段序列為基礎，在NCBI-BLAST中找到基因的保守區，在保守區利用軟件Primer?Premier?5.0設計引物，以Actin基因的表達為參照，采用半定量PCR法檢測目的基因的表達，重復3次；PCR反應的總體積為10μL；進行PCR擴增溫度如下：先94℃?3min，再94℃,?25s;?60℃,?25s;?72℃,?30?s,?28個循環后，72℃延長6?min，反應結束后，得擴增產物；

取擴增產物，加1/5倍體積的上樣緩沖液，經2%的瓊脂糖凝膠電泳15-30min后在紫外儀上觀察，并利用圖像軟件分析擴增產物的亮度；

以平均亮度增加或減弱2倍以上為標準，篩選并確定了芥菜鎘濃度大于1.00mg/kg誘導下特異表達的6個上調基因和6個下調基因，以此作為鎘污染檢測的基因；

所述芥菜鎘誘導下特異表達的6個顯著上調基因的引物（正向引物簡稱F,?反向引物簡稱R）具序列如下：?

UP1：F:5'-?CGGAGTGGCTAAGCTTGTTCG-3'???R:5'-CCACAAGACCAAACATCAGCG-3'???

UP2：F:5'-GCTGTCAAAGCTGGTGAAACC-3'???R:5'-?CCGCAATCCTCAGCTAGAGC-3'?

UP3：F:5'-AAGAGCAAGCCAAGGAAGG-3'?????R:5'-GGCACTGTGGGCGAAGTAG-3'

UP4：F:5'-AATGGCGGATTTGAGGGAC-3'??????R:?5'-GCGGTGGTTGGTGTTTGTT-3'

UP?5：F:5'-CTCTTTCAGACCGTTGTTC-3'???????R:5'-TCACTTTCTGCTCCTTTAT-3'

UP?6：F:5'-GGTGGATGTGAACGGTAAG-3'?????R:5'-CCAACGCAGTTTGAATGTC-3'

所述芥菜鎘誘導下特異表達的6個顯著下調基因的引物（正向引物簡稱F,?反向引物簡稱R）具序列如下：?

DOWN1：F:5'-TTTTCTTCCGACAAATCAG-3'???R:5'-CAATATGTTCCCTTTCACC-3'

DOWN?2：F:5'-GCTTCTCAAGTACAACCCTA-3'???R:5'-CTAAACATTTCAAACCCTCA-3'

DOWN?3：F:?5'-GTAAGTGGGTTTGTGAGGT-3'???R:5'-GAAATTGAGACAGGCTGAT-3'

DOWN?4：F:5'-ACTTCGCTGACTCGGCTTGG-3'???R:5'-CAGACGGCGGCGGTAAAA-3'

DOWN?5：F:5'-GGTATTAGGGTTTGGCTCG-3'???R:5'-TGGTCATTCTCCGTCTCA-3'???

DOWN?6：F:?5'-CAGCCCTGAATCCTGACC-3'???R:5'-GCCTTGACCAAAGCCACA-3'?

步驟二：檢測環境中的鎘污染，方法如下:

?1)采集待檢測環境及非污染對照區中的在分類學上屬于同種的蕓薹屬植物的根，進行根的總RNA的提取和反轉錄；

2）以Actin基因的表達為參照，采用半定量PCR法，重復3次；PCR反應的總體積為10μL；

進行PCR擴增溫度如下：先94℃?3min，再94℃,?25s;?60℃,?25s;?72℃,?30?s,?28個循環后，72℃延長6?min，反應結束后，得擴增產物；

每個樣品取擴增產物，加1/5倍體積的上樣緩沖液，經2%的瓊脂糖凝膠電泳15-30min后在紫外儀上觀察，并利用圖像軟件分析擴增產物的亮度；

3)作出結論:?若用引物UP1、?UP2、UP3、UP4、UP5和UP6擴增的待檢測環境中蕓薹屬植物的亮度比對照都增加2倍以上，且引物?DOWN1、?DOWN2、DOWN3、DOWN4、DOWN5和DOWN6擴增的待檢測環境中蕓薹屬植物的亮度比對照都減弱2倍以上則可以判定檢測環境中鎘污染的濃度大于1.00mg/kg，根據國家環境質量標準（GB15618-1995）認定待檢測環境不適合農業生產。