[發(fā)明專利]Trx-hPTN融合蛋白及其生產方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210415337.X
• 申請日: 2012-10-25
• 公開（公告）號: CN102965387A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發(fā)明（設計）人: 吳東海;李洪波;胡興;徐愛民;李鵬;金守光;李娜
• 申請（專利權）人: 中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K19/00
• 代理公司: 廣州華進聯(lián)合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香;秦雪梅

技術領域

本發(fā)明涉及應用重組DNA技術生產基因工程蛋白藥物技術，具體來說涉及一種Trx-hPTN融合蛋白及其生產方法。

背景技術

多效生長因子（pleiotrophin，PTN）最早是從牛的子宮中發(fā)現(xiàn)的，對成纖維細胞具有微弱增殖作用的一種肝素結合細胞因子。PTN基因包含5個外顯子及一個小的非翻譯的外顯子，編碼168個氨基酸，其中包括一個與分泌有關的32個氨基酸組成的信號肽識別序列，最終分泌的具有生物功能的成熟蛋白由136個氨基酸殘基組成。研究表明其具有多種信號功能，包括促進神經系統(tǒng)的發(fā)育和膠質母細胞的特異性分化，促進血管發(fā)生，刺激細胞增殖和遷移、促進神經系統(tǒng)及骨發(fā)育等功能。

PTN正常表達于胚胎期，在成年的健康組織中很少表達，但目前已發(fā)現(xiàn)包括乳腺癌在內的多種腫瘤中都有PTN的高表達及內源性PTN的持續(xù)活化。PTN是一種腫瘤相關信號因子已被越來越多的研究證實，其在不同類型乳腺癌中的表達也有大量報道。PTN的生物學活性分別由3種獨立的受體介導：

SDC3(N-Syndecan)、受體蛋白酪氨酸磷酸酶和間變性淋巴瘤激酶。在PTN刺激15min后的細胞中，β-catenin與E-cadherin免疫共沉淀顯著地減少，從而導致細胞間黏附力降低，該作用是由PTN調節(jié)β-catenin的酪氨酸磷酸化水平而引起的。而這種細胞間黏附力的減弱恰恰是腫瘤從原位走向侵襲和轉移的開始。研究發(fā)現(xiàn)，PTN/RPTPβ/ζ信號通路能活化下游的黏附因子和PI3K通路，抑制肺癌細胞的遷移。綜上所述，PTN可通過下游信號通路調節(jié)包括MMP在內的多種靶基因的表達，從而促進乳腺癌的浸潤和轉移。

科學家日前通過實驗確認，多效生長因子可促進造血干細胞擴張和再生。他們將多效生長因子注入骨髓生長被抑制的實驗鼠體內，后者的骨髓干細胞生長速度與未注射多效生長因子的實驗鼠相比提高了10倍，而且不會導致實驗鼠出現(xiàn)癌變。這項成果將來有望使更廣泛的人群受益于臍帶血移植，對正在接受化療或放療的患者而言，利用多效生長因子進行治療或許具有加速患者血液和免疫系統(tǒng)恢復的潛力。

隨著對人多效生長因子（human?pleiotrophin，hPTN）作用機制的不斷深入，人hPTN作為藥物，其需求量將大大增加。目前，雖然該蛋白已利用大腸桿菌菌進行了表達，但它們的方法都存在諸多不足之處。例如：目標蛋白的表達量很低或表達產物通常以包涵體形式存在，要通過變性復性得復雜操作才能得到活性形式的hPTN，從而減少了活性蛋白的產率；其次以融合蛋白的形式進行了表達，但融合的片段分子量很大且影響到了表達的重組蛋白的生物活性，所以必須要切除融合的片段，而要將PTN蛋白、融合、未經切割的融合蛋白及加入的將融合片段與目標蛋白切除的相應蛋白酶分離開來需要很多的蛋白質純化步驟，純化的步驟多，蛋白質的得率就明顯降低，且更可能導致目標產物的失活。因此，開發(fā)出一種可以大量、快速、低成本的制備具有生物活性的PTN蛋白是十分必要的。

發(fā)明內容

基于此，本發(fā)明提供一種Trx-hPTN融合蛋白及其生產方法，根據(jù)該方法可獲得大量穩(wěn)定、可溶且具有生物活性的Trx-hPTN融合蛋白。

解決上述問題的技術方案如下：

一種Trx-hPTN融合蛋白的生產方法，主要包括以下步驟：

（1）克隆hPTN基因：用特異引物擴增出完整的基因片段，所用hPTN特異引物中引入BamH?I酶切位點和Hind?III酶切位點，回收PCR產物連接到質粒pMD20-T載體，得質粒hPTN/pMD20-T，經過測序確定為正確表達序列；

（2）構建原核表達載體：將表達載體pET32a(+)和步驟（1）所得的質粒hPTN/pMD20-T經過Hind?III及BamH?I雙酶切并純化回收，并利用T4DNA連接酶連接，得重組載體pET32a(+)/hPTN；

（3）大腸桿菌表達菌株轉化子的篩選：利用T4DNA連接酶連接，將步驟（2）所得的重組載體pET32a(+)/hPTN轉化到大腸桿菌TOP10菌株中，再從TOP10中提取重組載體pET32a(+)/hPTN；用熱激法將重組載體pET32a(+)/hPTN轉入到大腸桿菌表達菌株Rosetta中，LB?Amp抗性平板篩選得到包含有重組質粒pET32a(+)/hPTN的大腸桿菌表達菌株轉化子；