[發明專利]Trx-hPTN融合蛋白及其生產方法

無效

• 申請號: 201210415337.X
• 申請日: 2012-10-25
• 公開（公告）號: CN102965387A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發明（設計）人: 吳東海;李洪波;胡興;徐愛民;李鵬;金守光;李娜
• 申請（專利權）人: 中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K19/00
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香;秦雪梅

1.一種Trx-hPTN融合蛋白的生產方法，其特征在于，主要包括以下步驟：

（1）克隆hPTN基因：用特異引物擴增出完整的基因片段，所用hPTN特異引物中引入BamH?I酶切位點和Hind?III酶切位點，回收PCR產物連接到質粒pMD20-T載體，得質粒hPTN/pMD20-T，經過測序確定為正確表達序列；

（2）構建原核表達載體：將表達載體pET32a(+)和步驟（1）所得的質粒hPTN/pMD20-T經過Hind?III及BamH?I雙酶切并純化回收，并利用T4DNA連接酶連接，得重組載體pET32a(+)/hPTN；

（3）大腸桿菌表達菌株轉化子的篩選：利用T4DNA連接酶連接，將步驟（2）所得的重組載體pET32a(+)/hPTN轉化到大腸桿菌TOP10菌株中，再從TOP10中提取重組載體pET32a(+)/hPTN；用熱激法將重組載體pET32a(+)/hPTN轉入到大腸桿菌表達菌株Rosetta中，LB?Amp抗性平板篩選得到包含有重組載體pET32a(+)/hPTN的大腸桿菌表達菌株轉化子；

（4）Trx-hPTN融合蛋白的表達：將步驟（3）所得的大腸桿菌重組轉化子在37℃培養至OD₆₀₀為0.4-0.8時，加入濃度為0.05-1.0mM的IPTG，于25-37℃誘導4-10小時，超聲破碎，離心取上清液，得到重組融合蛋白Trx-hPTN；

（5）Trx-hPTN融合蛋白的純化：利用鎳親合層析法對Trx-hPTN融合蛋白進行純化。

2.根據權利要求1所述的生產方法，其特征在于，步驟（1）所述hPTN特異引物為：

PTN-上游引物：5’-GCGGATCCATGCAGGCTCAACAGTACCAG-3’；

PTN-下游引物：5’-GCAAGCTTTTAATCCAGCATCTTCTCCTGTTTC-3’。

3.根據權利要求1所述的生產方法，其特征在于，步驟（3）所述的表達菌株為大腸桿菌Rosetta。

4.根據權利要求1所述的生產方法，其特征在于，步驟（5）所述的鎳親合層析方法中：所用的洗脫液為含有100-400mM咪唑的pH?8.0Tris-HCl溶液；所得的Trx-hPTN融合蛋白的純度為90%以上。

5.根據權利要求1所述的生產方法，其特征在于，步驟（5）所述的Trx-hPTN融合蛋白的純化方法為利用鎳親合層析對Trx-hPTN融合蛋白進行純化，然后再采用PBS透析和超濾濃縮。

6.根據權利要求4所述的生產方法，其特征在于，步驟（5）所述的鎳親合層析方法中：所用的洗脫液為含有400mM咪唑的pH?8.0Tris-HCl溶液。

7.根據權利要求1－6任一項所述的生產方法制得的Trx-hPTN融合蛋白。