[發明專利]鹿豬牛羊馬驢兔雞的PCR鑒定用引物體系

有效

• 申請號: 201210411963.1
• 申請日: 2012-10-25
• 公開（公告）號: CN102876805A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 周翠霞;楊彥鵬;黨平
• 申請（專利權）人: 蘇州市紅冠莊國藥飲片有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 昆山四方專利事務所 32212
• 代理人: 盛建德

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，尤其涉及鹿、豬、牛、羊、馬、驢、兔和雞的PCR鑒定用引物體系及PCR鑒定方法，適用于上述八種動物血液制品的快速檢測及鑒定，尤其適用于鹿血液制品的快速防偽鑒定。

背景技術

鹿血為鹿科動物的血液，據《本草綱目》記載：“鹿血大補虛損，益精血，解痘毒、藥毒”。鹿血作為傳統的珍貴中藥材具有不可替代性，其藥用價值一直以來得到廣泛認可和深入開發，產品系列不斷豐富，包括鹿血酒、鮮鹿血、鹿血晶等，所產生的市場價值和需求十分巨大。在經濟利益的驅使下，不法分子常常會利用其它常見動物血液假冒鹿血，或在鹿血產品中摻入其他常見動物血以次充好來降低成分，常用的動物血液為豬、牛、羊、馬、驢、兔和雞的血液。但目前鹿血的品質檢測一直沒有很好的手段，傳統目測及理化分析方法無法有效地判別這些性質十分相似的血液樣品。為了確保鹿血的真實度和純度，從源頭上控制鹿血的品質，開發用于鑒別常見物種血液樣品的簡便快速的現代分子生物學檢測技術具有迫切性和必要性。

聚合酶鏈式反應（PCR）技術具有響應快速、靈敏度高且特異性好的優點，是當前應用最廣的先進分子生物學技術，該技術利用特異的引物可以從微量樣品中擴增出相應特定的DNA片段，達到放大核酸信號的目的。同時，PCR具有非常高的反應特異性，可以區分少至幾個核苷酸堿基的差異，因此PCR技術在診斷性檢測領域得到廣泛深入的應用。由于在進化過程中不同物種的遺傳物質DNA存在序列上的保守性和多變性，尤其在物種內部具有較高的保守性，而物種之間存在較大的差異性。利用PCR技術上述的高度靈敏性和特異性，可以區分不同物種材料，尤其是具有較高經濟價值的產品。而線粒體DNA相對基因組DNA具有更高的突變率和遺傳多變性，因此線粒體DNA序列的差異常用于不同物種及物種內部的進化分析及診斷檢測。

目前國內外針對上述報道的文獻較少，且大多是針對少量物種進行的。如Dalmasso?A等人為抑制瘋牛病傳播，防止在其他產品中摻入牛制品，利用多元PCR技術鑒定飼料中動物成分，使用了四對引物分別針對反芻動物、家禽、魚和豬，引物設計時針對的基因為：12S?rRNA，tRNA?Val及16S?rRNA（Dalmasso?A,?Fontanella?E,?Piatti?P,?Civera?T,?Rosati?S,?Bottero?MT,?A?multiplex?PCR?assay?for?the?identification?of?animal?species?in?feedstuffs.?Mol.?Cell.?Probes,?2004,?18:?81-87.）。Ghovvati,?S.等人為鑒定工廠肉制品中是否摻假，防止伊斯蘭教食品中摻入豬肉制品，設計了分別針對反芻動物、家禽及豬的三對引物，引物設計時針對的基因為：12S?rRNA及16S?rRNA（Ghovvati,S.,?M.R.?Nassiri,?S.Z.?Mirhoseini,?A.H.?Moussavi,?A.?Javadmanes,?Fraud?identification?in?industrial?meat?products?by?multiplex?PCR?assay.?Food?Control,?2009,20:696-699.）。又如Dai-Ming?Zha等人為檢測鹿產品中的摻假情況，設計了四對分別針對牛、羊、家禽和豬的引物，引物設計時針對的基因為：tRNA?Val和16S?rRNA（Dai-Ming?Zha,?Xiu-Mei?Xing,?Fu-He?Yang,?A?multiplex?PCR?assay?for?fraud?identification?of?deer?products,?Food?Control,?2010,21:1402-1407.）。但上述方案并未設計針對鹿的引物，因此雖然能測定樣品中是否含有這四類物質，但不能確定是否是鹿產品。

由以上具有代表性的研究結果可以看出，這些檢測存在下列不足：（1）檢測范圍窄，一次只能檢測少量物種，基本不會大于四個。這是由于在同一個總DNA模板體系中，引物對的數量越多，引物對與總DNA模板之間的相互干擾越嚴重，PCR反應的特異性也越不能保證；（2）沒有建立對大量常見物種的快速且特異性高的引物體系及檢測方法，這也會造成漏檢現象。

發明內容

為了克服上述現有技術中存在的不足，本發明提供了一種鹿豬牛羊馬驢兔雞的PCR鑒定用引物體系，該引物體系及用該引物體系進行的鑒定方法可快速且特異性高的檢測鹿豬牛羊馬驢兔雞血液制品的真偽及其是否有摻假，尤其適用于鹿血產品鑒定與檢測，其對常見物種的檢測覆蓋面廣泛。