[發明專利]芋螺毒素的生物學制備方法及其產品和用途

無效

• 申請號: 201210410292.7
• 申請日: 2012-10-24
• 公開（公告）號: CN102876683A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 張志芳;李軼女;易詠竹;劉興健;鄭學星;邊大勇;王國增;江峰;鐘魯龍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/866;C12N5/10;C07K14/435;A61K38/17;A61P25/04;A61P25/00;A61P25/30
• 代理公司: 北京市德權律師事務所 11302
• 代理人: 余光軍

技術領域

本發明涉及芋螺毒素的制備方法，尤其涉及一種芋螺毒素的生物學制備方法以及由該生物學方法制備得到的產品以及它們在鎮痛、神經修復或戒斷毒癮中的醫藥用途，屬于芋螺毒素的生物學制備領域。

背景技術

海洋毒素是近二十年一個新興的研究領域，其重要進展之一是發現了一些毒性極大的小肽類毒素，其中軟體動物芋螺(conus)分泌的芋螺毒素(conotoxin)是備受重視的一類神經毒素，是迄今發現的最小核酸編碼的動物神經毒素肽，也是二硫鍵密度最高的小肽。芋螺毒素具有化學結構新穎，生物活性強，作用靶位選擇性高等特點，已成為藥理學和神經科學的有力工具和新藥開發的新來源。依照芋螺毒素對神經肌肉系統的作用部位，將其分為四類：1、α-芋螺毒素(α-conotoxin)：其與銀環蛇毒素相似，作用于神經突觸后乙酰膽堿受體(AchR)起阻斷作用；2、μ-芋螺毒素(μ-conotoxin)：其與河豚毒素相似，在活化相起作用，專一抑制電壓敏感性鈉通道；3、ω-芋螺毒素(ω-conotoxin)，專一阻斷神經末梢突觸前電壓敏感性鈣通道；4、δ-芋螺毒素(δ-conotoxin)，專一作用于電壓敏感性鈉通道，在非活化相起作用，延長動作電位持續時間。芋螺毒素對靶受體的作用具有高親和性和高特異性，可以區分不同的受體亞型。雖然不同的芋螺毒素的氨基酸序列變化非常大，但它們的結構上的差異不大，尤其是表達后加工的過程基本是一致的。

αCTx(alpha?conotoxin?Tx)有望被直接開發成藥物或作為新藥的先導化合物。作用于N型VSCCs的芋螺毒素能抑制中樞神經系統的與痛覺相關的神經遞質(如谷氨酸和P物質)釋放，從而減輕動物的神經性疼痛，并引起了人們希望將其開發成為新的肽類止痛劑的濃厚興趣。αCTx有望用于慢性疼痛的治療，它相對于嗎啡，具有療效好、不成癮的獨特優點；CTx具有比嗎啡藥效更強和持續時間更長的鎮痛效果，是通過阻斷外周初級傳入神經元的nAChRs而發揮止痛作用，其給藥更方便(可肌注或脂肪注射)，同時也無嗎啡引起的副反應(如便秘、呼吸抑制等)，極有望開發成為高效止痛藥物。此外αCTx能選擇性阻斷nAChRs的某種亞型，除有止痛效果外，也有望開發成用于治療焦慮癥、帕金森氏病、肌肉緊張和高血壓等病癥的藥物。alpha?A?conotoxin?Tx1即是目前研究比較多的一種αCTx。

迄今尚未見有芋螺毒素高活性的體外表達的文獻報道，可能原因有以下兩點：1、在原核表達系統，無法加工去除N-端信號肽序列，無法解決C-端酰胺化問題；2、芋螺毒素分子小，堿性氨基酸較多，因此難于形成特定活性構象。由于以上原因，大部分實驗室為獲得具有生物活性的芋螺毒素只好轉向化學合成。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種優化的芋螺毒素αACT1基因，該基因能夠在昆蟲宿主或細胞中高效表達具有生物學活性的芋螺毒素。

本發明的目的之二是提供一種芋螺毒素的生物學制備方法。

本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：

本發明將芋螺毒素αACT的原始基因序列(GenBank：AF146352.1，其核苷酸序列為SEQ?ID?No.1所示，所編碼的氨基酸序列為SEQ?IDNo.3所示)根據家蠶和多角體病毒密碼子偏好性進行改造，采取了調整了GC含量及不宜峰(以延長mRNA的半衰期)、去除常用限制性內切酶位點以及原始序列中含有串聯的稀有密碼子(減少翻譯序列甚至解除翻譯裝置)，破除那些影響mRNA穩定性及其與核糖體結合的莖環結構等一系列優化手段，得到優化后的芋螺毒素基因(αACT1)，其核苷酸序列為SEQ?ID?No.2所示，本發明進一步的在SEQ?ID?No.2所示核苷酸序列的5’端加上BamHI酶切位點和kozak序列，3’端加上EcoRI，得到SEQIDNo.4所示的核苷酸序列。優化后的芋螺毒素αACT1基因能夠在家蠶等昆蟲宿主或細胞中高效表達具有生物學活性的芋螺毒素。

本發明進一步提供了一種芋螺毒素的生物學制備方法，該方法包括以下步驟：

(1)將芋螺毒素基因克隆到桿狀病毒運載載體的表達盒中，構建得到重組轉移表達載體；(2)將所構建的重組轉移表達載體與桿狀病毒DNA共轉染昆蟲細胞，獲得重組桿狀病毒；(3)用重組桿狀病毒感染昆蟲宿主或昆蟲細胞；培養被感染的昆蟲宿主表達有活性的芋螺毒素；收獲并純化所表達的產物(即：芋螺毒素)，即得。