[發明專利]一種誘導間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法及其在骨關節炎中的應用

有效

• 申請號: 201210410047.6
• 申請日: 2012-10-24
• 公開（公告）號: CN102899287A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 劉擁軍;王立華;許放;董方
• 申請（專利權）人: 天津和澤干細胞科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/0775;A61K35/44;A61P19/02;A61P29/00
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技術領域

本發明涉及干細胞技術領域，具體來說，涉及向軟骨誘導的UC-MSCs的制備方法及其在骨關節炎中的應用。

背景技術

關節軟骨是一種負重結締組織，常因腫瘤，運動、退行性變或老年性疾病造成損傷；然而關節軟骨自身修復能力有限，給臨床治愈軟骨缺損造成了很大困難。近些年出現了多種治療軟骨缺損的方法，包括自體軟骨細胞移植、微裂縫和鑲嵌成形術，但這些方法各自都有其局限性。近年來，組織工程軟骨成為軟骨修復研究的新熱點，間充質干細胞(Mesenchymal?stem?cells,?MSCs)是其當前最有前景的種子細胞。MSCs是來源于發育早期中胚層和外胚層的一類多能干細胞，最初在骨髓中發現。目前MSCs的主要來源為成人骨髓，但成人骨髓源MSCs細胞數量及增殖分化潛能隨年齡的增大而下降，病毒感染率較高，且供者MSCs的采集須行骨髓穿刺術，來源受到限制。研究發現，MSCs在人胎兒和出生后多種組織廣泛存在，包括骨膜、脂肪、羊水、真皮、牙、骨骼肌、胎肺、胎肝和臍血等。在前一個國家自然基金《臍帶間充質干細胞生物特性、造血支持研究及在移植中的應用》（30570905）的資助下，我們應用改進的膠原酶和胰酶相結合的酶直接消化法，通過磁珠篩選，從臍帶中獲得了大量的MSCs。并建立了一種可以分離擴增臍帶MSCs的方法，且操作簡單易行（ZL200910242375.8）。根據本方法，90%足月臍帶可以分離出MSCs，獲得1×10⁹?MSCs細胞，充分滿足臨床和實驗研究的需要。

現有技術尚沒有將臍帶源間充質干細胞向軟骨誘導分化的嘗試，我們將臍帶源間充質干細胞作為我們的種子細胞，將其誘導分化為無支架軟骨，并對其修復受損關節軟骨的能力進行了研究，具有重要的臨床指導意義。

發明內容

本發明在第一方面提供了一種誘導間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法，其中，在15ml尖底離心管中使用小球法誘導培養間充質干細胞，并且每隔約24小時輕輕晃動離心管一次，使細胞球與管底分離。

在一個特定的實施方案中，使用的誘導分化培養基為高糖?DMEM?加入100?μg/ml丙酮酸鈉，10?ng/ml?TGFβ3?，100?nM地塞米松，25?μg/ml維生素C，40?μg/ml脯氨酸，1×?ITS?+?1?premix；誘導分化培養時間為21天。

優選地，所述間充質干細胞為臍帶源間充質干細胞。

在本發明的第二個方面，提供了根據本發明的方法制備的向軟骨細胞分化的間充質干細胞。

優選地，所述間充質干細胞為臍帶源間充質干細胞。

在本發明的第三個方面，提供了向軟骨細胞分化的間充質干細胞在制備治療骨關節炎的藥物中的應用。

優選地，所述間充質干細胞為臍帶源間充質干細胞。

本發明具有如下優點：

1.?采用小球法誘導培養間充質干細胞，可以制得無支架軟骨，每隔約24小時輕輕晃動離心管一次，使細胞球與管底分離，保證了細胞球與誘導分化培養基充分接觸，細胞球中的間充質干細胞分化狀態均一。

2.?誘導分化培養基中使用TGFβ3代替了常用的TGFβ1，達到了更好的誘導效果。

3.?臍帶源間充質干細胞相對于常規的骨髓源間充質干細胞分離制備簡便，來源豐富。

附圖說明

圖1?向軟骨誘導分化21天后的UC-MSCs小球的甲苯胺藍染色結果，紫紅色證明為軟骨細胞。

圖2?大鼠骨關節炎模型經向軟骨誘導的UC-MSCs細胞懸液治療后的HE染色結果。

A?正常對照組；B?模型組；C關節腔內細胞懸液治療組1；D關節腔內細胞懸液治療組2；E尾靜脈注射細胞懸液治療組3；?F尾靜脈注射細胞懸液治療組4。

具體實施方式

實施例1?臍帶源間充質干細胞向軟骨細胞誘導

1.?MSC生長培養基單層擴增臍帶源間充質干細胞：