[發明專利]一種誘導間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法及其在骨關節炎中的應用

有效

• 申請號: 201210410047.6
• 申請日: 2012-10-24
• 公開（公告）號: CN102899287A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 劉擁軍;王立華;許放;董方
• 申請（專利權）人: 天津和澤干細胞科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/0775;A61K35/44;A61P19/02;A61P29/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種誘導間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法，其中，在15ml尖底離心管中使用小球法誘導培養間充質干細胞，并且每隔約24小時輕輕晃動離心管一次，使細胞球與管底分離。

2.權利要求1所述的方法，其中，使用的誘導分化培養基為高糖DMEM加入100μg/ml丙酮酸鈉，10ng/ml?TGFβ3，100nM地塞米松，25μg/ml維生素C，40μg/ml脯氨酸，1×ITS+1premix。

3.權利要求1或2所述的方法，其中，誘導分化培養時間為21天。

4.權利要求1或2所述的方法，其中，所述間充質干細胞為臍帶源間充質干細胞。

5.權利要求4所述的方法，其步驟包括：

1)在每個75cm²培養瓶中加入13.5ml間充質干細胞生長培養基培養P3代臍帶源間充質干細胞，細胞生長達到70-80%融合，用D-Hank’s洗液洗兩遍后，加入1.5ml胰酶-EDTA進行消化，顯微鏡下觀察，細胞呈現圓球狀態時，用1.5ml人血清終止消化，將細胞吸入50毫升離心管中，充分混勻后，取200微升計數確定細胞數量，其余細胞懸液離心，1000rpm，10min；倒掉離心后的上清，以1:3的比例傳代，培養至P4代，細胞生長達到70-80%融合，用D-Hank’s洗液洗兩遍后，加入1.5ml胰酶-EDTA進行消化，顯微鏡下觀察，細胞呈現圓球狀態時，用1.5ml人血清終止消化，將細胞吸入50毫升離心管中，充分混勻后，離心，1000rpm，10min；倒掉離心后的上清，加入30ml?D-hank’s洗液，混勻后再次離心，倒掉上清，再次加入30ml?D-hank’s洗液，混勻后，取出200微升計數，其余細胞懸液離心，1000rpm，10min；離心后去掉上清；

其中，所述間充質干細胞生長培養基為DMEM/F12加入10%人血清、20ng/ml?EGF、5ng/ml?FGF2；

2)用間充質干細胞生長培養基重懸細胞，調整細胞濃度至1×10⁶細胞/ml；

3)小球法誘導培養細胞：將1ml含有1×10⁶個細胞的細胞懸液加入15ml尖底離心管中，240g離心5分鐘，將離心管放入37℃，5%CO₂細胞培養箱中，約24小時后，輕輕晃動離心管，使細胞球與管底分離，之后換加入誘導分化培養基；每隔24小時輕輕晃動離心管一次，使細胞球與管底分離，每兩天更換一次誘導分化培養基；21天后，取出小球；

其中，所述誘導分化培養基為高糖DMEM加入100μg/ml丙酮酸鈉，10ng/mlTGFβ3，100nM地塞米松，25μg/ml維生素C，40μg/ml脯氨酸，1×ITS+1premix。

6.根據權利要求1-5任一項的方法制備的向軟骨細胞分化的間充質干細胞。

7.權利要求6所述的向軟骨細胞分化的間充質干細胞，其中所述間充質干細胞為臍帶源間充質干細胞。

8.權利要求6或7所述的向軟骨細胞分化的間充質干細胞在制備治療骨關節炎的藥物中的應用。