[發明專利]在動物細胞或動物組織中表達外源基因的方法

有效

• 申請號: 201210408558.4
• 申請日: 2012-10-24
• 公開（公告）號: CN102994550A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 張志芳;姚斌;李軼女;易詠竹;劉興健;張渭蛟;沈桂芳
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/66;A61K48/00
• 代理公司: 北京市德權律師事務所 11302
• 代理人: 余光軍

技術領域

本發明涉及一種表達外源基因的方法，尤其涉及一種將外源基因導入到動物細胞或動物組織中并進行表達的方法，屬于基因治療領域。

背景技術

基因治療自從1990年成功應用于SCID-X1患者的治療至今已經有二十幾年，一直以來基因治療的研究的很大的側重點在于基因轉移載體的選擇。由于將外源基因呈遞到機體內的真核細胞中并表達的工作基本上是需要病毒載體來完成的，所以各種病毒載體在臨床基因治療中的選擇和應用，在這些年來也是一個研究的重點，其中腺相關病毒載體（adeno-associated?virus，AAV）是最近研究中最為成功的，但同時也存在一些問題。

目前，國內外關于基因治療載體的選擇問題開始偏向于桿狀病毒載體，其中，最常用的是桿狀病毒載體是Autographa?californica?multiple?nucleopolyhedrovirus（AcMNPV）；它是一類專一性感染節肢動物的大型桿狀包膜病毒，90-180Kb之間的環狀雙鏈DNA基因組包裝在桿狀衣殼內。由于近年來關于其研究越來越多并且越來越深入，加之其操作安全方便，在用于各種外源基因的表達并作為一種新型的基因治療載體方面受到高度重視（Cory?and?Bishop,1997,Molecular?Biotechnology,303-313）。有些早期初步探索中闡述有一些桿狀病毒作為基因轉移表達載體在哺乳動物細胞中作用的困難和缺點（Sandig?et?al.,1996,Journal?of?Molecular?Medicine,205-212），但是在最近的研究中發現桿狀病毒作為一種新型的哺乳動物細胞基因轉移載體具有過去所采用的一些載體所不具備的特點，如：重組桿狀病毒構建方便，易于大規模體外培養；外源基因容量大；感染哺乳動物細胞后不具備細胞毒性，安全性好，不會整合到細胞的基因組中，不會進行病毒DNA復制，其自身啟動子在哺乳動物細胞內沒有活性等。然而，用AcMNPV做為哺乳動物的外源基因呈遞（基因治療）的載體存在著非常難以克服的困難，即動物血液中的補體成分能夠滅活AcMNPV病毒粒子，使外源基因導入哺乳動物細胞的效率非常低，由此失去實用價值（Sandig?et?al.,1996,Hum.Gene?Ther.7:1937-1945；Hofmann?and?Strauss,1998，Gene?Ther.5:531-536）。上述問題限制了桿狀病毒AcMNPV在基因治療中的應用范圍，使其應用范圍基本限于哺乳動物細胞，而不能用于生物個體的應用。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種將外源基因導入哺乳動物細胞或生物個體的各個組織中進行基因呈遞的家蠶桿狀病毒載體；

本發明的目的之二是提供一種構建所述基因呈遞的家蠶桿狀病毒載體的方法；

本發明的目的之三是提供一種在動物細胞或動物組織中表達外源基因的方法。

本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：

一種將外源基因導入哺乳動物細胞或生物個體的組織中進行基因呈遞的家蠶桿狀病毒載體，包括骨架載體以及重組到骨架載體上的外源基因的表達盒；

所述骨架載體是家蠶桿狀病毒BmNPV?DNA；

所述外源基因的表達盒由啟動子、外源基因和終止子組成；其中，所述啟動子是哺乳動物啟動子，所述哺乳動物啟動子可以是CMV啟動子、人巨細胞病毒早期啟動子(CMV-IE)、人延伸因子1-亞基啟動子、Rous肉瘤長末端重復序列、人leukosialin基因啟動子、鼠3-磷酸甘油激酶l(PGKI)基因啟動子、人泛素蛋白(ubiquitin)C基因啟動子、由雞β-肌動蛋白啟動子和CMV增強子序列構成的雜合啟動子或鼠乳房瘤病毒(MMTV)啟動子等，優選為CMV啟動子（其核苷酸序列為SEQ?ID?No.3所示）或CAG啟動子；

所述的終止子優選是SV40-polyA尾終止子（其核苷酸序列為SEQ?ID?No.4所示）。

所述的外源基因可以是報告基因（例如，可以是綠色熒光蛋白EGFP基因或熒光素酶報告基因（SEQ?ID?No.2））、抗原基因、治療遺傳病用的相關基因、抑癌基因、其它功能基因或RNAi等。

本發明提供了一種將外源基因導入哺乳動物細胞或生物個體的組織中進行基因呈遞的家蠶桿狀病毒載體的構建方法，該方法包括：

（1）將外源基因的表達盒克隆到轉移載體上，構建得到含有外源基因的重組轉移載體；

（2）將所構建的含有外源基因的重組轉移載體與桿狀病毒共轉染昆蟲細胞進行同源重組，即得。