[發(fā)明專利]在動物細(xì)胞或動物組織中表達(dá)外源基因的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210408558.4
• 申請日: 2012-10-24
• 公開（公告）號: CN102994550A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張志芳;姚斌;李軼女;易詠竹;劉興健;張渭蛟;沈桂芳
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/66;A61K48/00
• 代理公司: 北京市德權(quán)律師事務(wù)所 11302
• 代理人: 余光軍

1.將外源基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞或生物個體的組織中進(jìn)行基因呈遞的家蠶桿狀病毒載體，其特征在于：包括骨架載體以及重組到骨架載體上的外源基因的表達(dá)盒；所述骨架載體是家蠶桿狀病毒BmNPV?DNA；所述外源基因的表達(dá)盒由哺乳動物啟動子、外源基因和終止子組成。

2.按照權(quán)利要求1所述的家蠶桿狀病毒載體，其特征在于：所述哺乳動物啟動子是CMV啟動子、人巨細(xì)胞病毒早期啟動子、人延伸因子1-亞基啟動子、Rous肉瘤長末端重復(fù)序列、人leukosialin基因啟動子、鼠3-磷酸甘油激酶l基因啟動子、人泛素蛋白C基因啟動子、由雞β-肌動蛋白啟動子和CMV增強(qiáng)子序列構(gòu)成的雜合啟動子或鼠乳房瘤病毒啟動子；所述的終止子是SV40-polyA尾終止子。

3.按照權(quán)利要求1所述的家蠶桿狀病毒載體，其特征在于：所述的外源基因是報告基因、抗原基因、治療遺傳病用的相關(guān)基因、抑癌基因或RNAi；其中，所述的報告基因是綠色熒光蛋白基因或熒光素酶報告基因。

4.一種構(gòu)建權(quán)利要求1-3任何一項所述家蠶桿狀病毒載體的方法，該方法包括：

（1）將外源基因的表達(dá)盒克隆到轉(zhuǎn)移載體上，構(gòu)建得到含有外源基因的重組轉(zhuǎn)移載體；所述外源基因的表達(dá)盒由哺乳動物啟動子、外源基因和終止子組成；（2）將所構(gòu)建的含有外源基因的重組轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，進(jìn)行同源重組，即得。

5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：

所述的外源基因是報告基因、抗原基因、治療遺傳病用的相關(guān)基因、抑癌基因、、或RNAi；其中，所述的報告基因優(yōu)選是綠色熒光蛋白EGFP基因或熒光素酶報告基因；

所述的轉(zhuǎn)移載體是pVL1393轉(zhuǎn)移載體；

所述哺乳動物啟動子是CMV啟動子、人巨細(xì)胞病毒早期啟動子、人延伸因子1-亞基啟動子、Rous肉瘤長末端重復(fù)序列、人leukosialin基因啟動子、鼠3-磷酸甘油激酶l基因啟動子、人泛素蛋白C基因啟動子、由雞β-肌動蛋白啟動子和CMV增強(qiáng)子序列構(gòu)成的雜合啟動子或鼠乳房瘤病毒啟動子；所述的終止子優(yōu)選是SV40-polyA尾終止子；

所述的桿狀病毒是BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV或TeNPV；優(yōu)先為家蠶桿狀病毒BmNPV。

所述的昆蟲細(xì)胞是家蠶細(xì)胞。

6.一種將外源基因?qū)雱游锛?xì)胞或動物個體組織并進(jìn)行表達(dá)的方法，包括：將權(quán)利要求1-3所述的家蠶桿狀病毒載體感染昆蟲宿主或昆蟲細(xì)胞；培養(yǎng)被感染的昆蟲宿主或昆蟲細(xì)胞對家蠶桿狀病毒載體進(jìn)行擴(kuò)增；收獲并純化所擴(kuò)增的產(chǎn)物。

7.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述的昆蟲宿主是家蠶、野蠶、蓖麻蠶、樟蠶、樗蠶、柞蠶、日本柞蠶、野天蠶、苜蓿尺蠖、茶尺蠖、甘蘭夜蛾、秋粘蟲、粉紋夜蛾、行軍蟲、棉鈴蟲、美國棉粘蟲、煙青蟲、煙草夜蛾、東方粘蟲或舞毒蛾；所述的昆蟲細(xì)胞是家蠶細(xì)胞、野蠶細(xì)胞、蓖麻蠶細(xì)胞、樟蠶細(xì)胞、樗蠶細(xì)胞、柞蠶細(xì)胞、日本柞蠶細(xì)胞、野天蠶細(xì)胞、苜蓿尺蠖細(xì)胞、茶尺蠖細(xì)胞、甘蘭夜蛾細(xì)胞、秋粘蟲細(xì)胞、粉紋夜蛾細(xì)胞、行軍蟲細(xì)胞、棉鈴蟲細(xì)胞、美國棉粘蟲細(xì)胞、煙青蟲細(xì)胞、煙草夜蛾細(xì)胞、東方粘蟲細(xì)胞或舞毒蛾細(xì)胞；

所述的感染是將家蠶桿狀病毒載體通過口食來感染1-5齡的昆蟲幼蟲或蛹體或透過表皮來感染1-5齡的昆蟲幼蟲或蛹體；優(yōu)選的，所述的感染是將家蠶桿狀病毒載體感染家蠶細(xì)胞或?qū)⒓倚Q桿狀病毒載體穿刺接種1-5齡的家蠶幼蟲或蛹體，在感染3-6天后收集含重組桿狀病毒的家蠶幼蟲或蛹的體液或組織勻漿；其中，所述的蛹體優(yōu)選為1-2天的早期嫩蛹。

8.權(quán)利要求1-3所述的家蠶桿狀病毒載體在制備基因治療藥物或DNA疫苗中的用途。

9.一種基因治療藥物或DNA疫苗，其特征在于，包括：權(quán)利要求1-3所述的家蠶桿狀病毒載體和藥學(xué)上可接受的輔料。

10.一種呈遞外源基因的口服制劑，其特征在于：包括基因呈遞有效量的權(quán)利要求1-3所述的純化的家蠶桿狀病毒載體和終濃度為25-35%的脂肪酸。