[發(fā)明專利]一種凝結(jié)芽孢桿菌的固體發(fā)酵生產(chǎn)方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210405874.6
• 申請日: 2012-10-23
• 公開（公告）號: CN103289910A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 夏新界;李本濤;印遇龍;何宏軒;王從峰;李愛科;佘銳萍;李剛;李帥偉
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州格拉姆生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A23K1/16;C12R1/07
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及固體發(fā)酵工程領(lǐng)域，尤其涉及一種凝結(jié)芽孢桿菌的固體發(fā)酵生產(chǎn)方法。?

背景技術(shù)

近年研究表明，益生菌可改善動物腸道菌群的平衡，增強(qiáng)動物機(jī)體免疫力，提高動物消化功能，促進(jìn)動物生長發(fā)育和提高動物生產(chǎn)性能等益生作用，其作為綠色飼料添加劑取代抗生素已得到廣泛應(yīng)用。?

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus?coagulans），革蘭氏陽性菌，不僅屬于硬（或厚）壁菌門，而且屬于腸道乳酸菌，又稱為“有孢子性乳酸菌”。是經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)的一種“普遍認(rèn)為安全”的桿菌類乳酸菌，口服后，凝結(jié)芽孢桿菌在動物的盲、結(jié)和直腸定植，發(fā)酵產(chǎn)生大量抗菌凝固素、乳酸、氨基酸、維生素和多種消化酶。?

凝結(jié)芽孢桿菌經(jīng)人工胃液（pH1.4）處理2小時后的存活率為95.29%，雙歧桿菌存活率為5.20%，乳酸桿菌的存活率為5.50%。研究表明凝結(jié)芽孢桿菌對人工胃液的酸性條件耐受性極強(qiáng)，其存活不受影響，明顯優(yōu)于其它微生態(tài)制劑，能順利通過胃進(jìn)入腸道，從而保證藥效的正常發(fā)揮，將凝結(jié)芽孢桿菌密封于塑料瓶內(nèi)，置于55℃干燥箱內(nèi)處理60小時后，測定活菌數(shù)的結(jié)果表明，仍不低于1億?cfu/g，水分含量無明顯改變，凝結(jié)芽孢桿菌制劑可以在室溫保存，有效期可達(dá)24個月。?

凝結(jié)芽孢桿菌的功能特點(diǎn)：（1）有效抑制有害菌的生長，改良腸道微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)腸道發(fā)育，增強(qiáng)腸道功能；（2）提高飼料品質(zhì)，促進(jìn)飼料的消化吸收，降低料肉比；（3）有效改善斷奶仔豬由于應(yīng)激和過敏反應(yīng)引起的菌群失調(diào)性腹泄；（4）無任何毒副作用，使用安全，并可降低環(huán)境中的氨氣、硫化氫等有害氣體，改善養(yǎng)殖環(huán)境。?

凝結(jié)芽孢桿菌活菌制劑能耐胃酸進(jìn)入腸道，分泌腸道蠕動促進(jìn)劑乳酸，促進(jìn)腸道蠕動，加速排便。同時凝結(jié)芽孢桿菌能促進(jìn)雙歧桿菌等腸道有益菌生長，分泌抗菌凝固素，抑制腸道內(nèi)變形桿菌和痢疾桿菌等腸道有害菌，減少氨、胺和吲哚等腸道毒素的產(chǎn)生，消除腸道毒素對腸的麻痹作用，避免腸道毒素吸收入血對肝、腦和皮膚等造成損傷，并能提高免疫功能，延緩衰老。凝結(jié)芽孢桿菌在腸道內(nèi)產(chǎn)生酶和維生素類營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收；同時凝結(jié)芽孢桿菌活菌制劑對右旋葡聚糖硫酸鈉誘發(fā)的大鼠實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎，能顯著地縮小潰瘍面積，降低髓過氧化物酶活性，有明顯的抗炎治療作用，它對大鼠免疫性潰瘍性結(jié)腸炎有顯著治療作用，能抑制IL-8、TNF-α等致炎癥因子的過度異常表達(dá)，抑制抗結(jié)腸抗體IgG的過度表達(dá)，降低B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，提高T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，糾正腸免疫紊亂，恢復(fù)腸免疫耐受力，消除炎癥和潰瘍，有效治療潰瘍性結(jié)腸炎，展現(xiàn)出了教好的應(yīng)用前景。?

根據(jù)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵條件單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選出最佳的碳源、氮源、磷源及2種對發(fā)酵水平影響較大的無機(jī)鹽類（MnSO₄·H₂O和MgSO₄·7H₂O），設(shè)計五因素四水平正交試驗(yàn)，并對結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析，優(yōu)化培養(yǎng)基組成，得到最佳固體培養(yǎng)基配方，固體干基：以玉米粉和豆餅粉為基礎(chǔ)料（玉米粉與豆餅粉的質(zhì)量之比為2:1）、KH₂PO₄?0.3~0.5wt%、MnSO₄·H₂O?0.02wt%和MgSO₄·7H₂O?0.125wt‰，將固體干基加入質(zhì)量比為1:1~2的無菌水，pH值為自然條件，攪拌均勻。將固體培養(yǎng)基在121℃溫度的條件下，高溫高壓滅菌20min，待冷卻后即可作為固體發(fā)酵培養(yǎng)基使用。經(jīng)過對凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化以得到其最佳培養(yǎng)溫度為37~40℃，起始?pH值7.0，接種量8~10%。目前的凝結(jié)芽孢桿菌的固體發(fā)酵生產(chǎn)方法，工藝過程復(fù)雜，不易簡單操作，活菌體密度較低，不能達(dá)到生產(chǎn)以及使用的要求。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種凝結(jié)芽孢桿菌的固體發(fā)酵生產(chǎn)方法，以克服現(xiàn)有的凝結(jié)芽孢桿菌的固體發(fā)酵生產(chǎn)方法存在的上述不足。?

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案如下：?

一種凝結(jié)芽孢桿菌的固體發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括以下步驟：

（1）菌種活化：將-80℃保存的菌種在固體種子培養(yǎng)基固體平板上劃線，在溫度為37~40℃的條件下培養(yǎng)20~24小時；

（2）制備一級種子：將活化的凝結(jié)芽孢桿菌，用接種環(huán)挑取三到五環(huán)接種于200?mL?液體種子培養(yǎng)基中，將三角瓶置于搖床中，在溫度為37~40℃和250rpm條件下，振蕩培養(yǎng)20~24小時后，制得一級種子菌；