[發明專利]生物樣本中美他卡韋及其代謝產物濃度的檢測方法

有效

• 申請號: 201210404133.6
• 申請日: 2012-12-24
• 公開（公告）號: CN103364498A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 謝少斐;余成霞;周東顏;黃海燕;李緯
• 申請（專利權）人: 南京長澳醫藥科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物樣本中2，3-雙脫氧鳥苷及其代謝產物濃度的檢測方法，特別涉及一種采用UPLC-MS/MS聯用技術分析美他卡韋及其代謝產物2，3-雙脫氧鳥苷和O₆-甲基鳥嘌呤含量的方法。

背景技術

目前，乙型肝炎已經成為全球性危害的態勢，而長期應用核苷類似藥物抗病毒治療仍是迄今切實可行的治療方式，2，3-雙脫氧鳥苷（代號：PNA）屬于核苷類抗乙肝病毒感染藥物，可能的藥理作用機制包括直接作用和間接作用。直接作用是指PNA作為鳥嘌呤類似物能直接進入肝細胞并在細胞內被磷酸化形成有活性的三磷酸鹽，該三磷酸鹽與HBV多聚酶的天然底物三磷酸脫氧鳥嘌呤核苷競爭，從而抑制HBV?DNA復制過程。間接作用是指PNA在血漿內很快代謝為2，3-雙脫氧鳥苷（DDG），因此可以作為DDG的前藥。DDG在細胞內被磷酸化為活性三磷酸鹽ddGTP，通過與多聚酶的結合抑制HBV?DNA的復制，導致DNA鏈合成中止。從目前的藥效和毒性研究結果來看，PNA是一個安全有效的抗乙型肝炎病毒的藥物。

對PNA的臨床前研究較多，大鼠灌胃給PNA后在體內迅速達峰且快速消除，似乎不是以原型藥物發揮藥效作用的，但是查閱國內外文獻，人體生物樣本中PNA及其代謝產物DDG和O₆-甲基鳥嘌呤的含量測定及其藥代動力學的研究卻未見報道。

發明內容

本發明通過對PNA人體中原型及主要代謝產物的研究，建立其血漿、尿樣濃度檢測方法，為進行PNA人體藥代動力學評價、制劑的藥學研究、質量標準、工業化生產質控指標的制定和臨床方案的制定提供依據。

發明人經過大量的實驗對比，最終篩選選定了本發明的實驗條件。該條件專屬性強，可以得到滿意的峰形及色譜保留時間，使分析時間相對較短。

本發明提供了一種生物樣本（血漿、尿）中PNA及其代謝產物DDG和O₆-甲基鳥嘌呤濃度的檢測方法，包括以下步驟：

(a)對生物樣品進行前處理：取待測樣品，加入內標和乙酸乙酯進行液液萃取，并取上清液吹干，復溶，取上清液，所述的內標為替硝唑溶液，所述的替硝唑的用量為使每1L樣品中含替硝唑重量為18-22μg，所述的乙酸乙酯的用量為使每1L樣品使用乙酸乙酯體積為3.0-6.0L；

(b)采用超高效液相色譜-質譜-質譜（UPLC/MS/MS）聯用儀測定上述上清液中PNA、DDG和O₆-甲基鳥嘌呤的濃度，其中，UPLC/MS/MS聯用的色譜條件是：色譜柱是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；內標法，以替硝唑作為內標；流動相為甲醇-醋酸銨水溶液的混合液，其比例范圍為（72±4）:（28±2），醋酸銨水溶液濃度為每1L水中含醋酸銨重量為7.8-38.5mg，pH為6.5-7.5，UPLC/MS/MS聯用的質譜條件是：離子源為ESI離子源，正離子檢測。

所述步驟(a)中乙酸乙酯體積優選為5L。

所述的色譜條件流動相由甲醇-醋酸銨水溶液組成，醋酸銨水溶液最佳濃度為0.2mmol/L，最佳pH為7.0，流動相最佳配比為72:28。

所述的UPLC/MS/MS聯用質譜條件中，掃描方式為選擇性離子檢測。

所述的生物樣品來源于人。

附圖說明

圖1A、1B、1C：分別為PNA、DDG和O₆-甲基鳥嘌呤的結構式。

圖2A、2B、2C、2D：分別為PNA、DDG、O₆-甲基鳥嘌呤和替硝唑的質譜掃面圖。

圖3A、3B、3C：為實施例一中PNA、DDG、O₆-甲基鳥嘌呤和替硝唑的選擇性反應檢測（SRM）色譜圖，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ分別代表PNA、DDG、替硝唑、O₆-甲基鳥嘌呤的色譜峰；其中：圖3A代表空白血漿；圖3B代表空白血漿中加入PNA（3000ng/mL）、DDG（3000ng/mL）、O₆-甲基鳥嘌呤（6000ng/mL）和內標替硝唑（20ng/mL）；圖3C代表血漿樣品。