[發明專利]基于已知E1查找特異性介導靶蛋白泛素反應E2-E3的方法

無效

• 申請號: 201210401583.X
• 申請日: 2012-10-19
• 公開（公告）號: CN102936618A
• 公開（公告）日: 2013-02-20
• 發明（設計）人: 張倩;周亞竟;陳慧卿;陳克平;麥維軍;劉曉勇;何遠清;李國輝;張磊;劉留;樊曉婷;宋惠芳
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12Q1/25
• 分類號: C12Q1/25;G01N33/68
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

1.?基于已知泛素活化酶E1查找特異性介導靶蛋白泛素反應結合酶E2和連接酶E3的方法，包括以下步驟：

（1）建立泛素化修飾反應的體外分析系統和E2的確定：泛素反應的體外分析系統是以經純化的GST融合靶蛋白作為基質，GST為對照，還包括：泛素，一種已知的活化酶E1，結合酶E2，未知的連接酶E3，Ubiquitin?aldehyde，ATP能量再生系統；E2的確定過程是將以上反應混合物于反應緩沖液中30⁰C下反應60分鐘；反應完成后，用Glutathione珠回收GST融合蛋白或GST的耦合物，SDS-PAGE電泳并轉膜后，以抗泛素的抗體Western?Blot檢測靶蛋白-泛素耦合物，從待選的多種E2中篩選出在已知E1情況下介導靶蛋白多泛素化反應最強的、與未知E3配對的E2；

（2）對特異性識別靶蛋白的E3進行查找：人體細胞抽提液經過免疫親和層析柱、Phenyl?Sepharose疏水層析柱、Mono?Q離子交換層析柱和Superdex?200分子篩層析柱4個不同性質的層析柱，每一步層析后，運用上述所建立的泛素反應體外分析系統，對各洗脫餾分檢測E3的活性，合并含E3活性的洗脫餾分峰，再通過下一個層析柱，在最后一步層析后，對含E3活性餾分峰進行質譜鑒定，確定出特異性識別靶蛋白的E3。

2.按照權利要求1所述方法，其特征在于：在建立的泛素化反應體外分析系統中所述的泛素活化酶E1為商業化人源重組UBE1，未知的E3源為Hela細胞S100餾分。

3.按照權利要求1所述方法，其特征在于：所述的用于篩選特異性介導靶蛋白泛素反應的E2是UbcH5c、UbcH2、UbcH3(Cdc34)和UbcH13/Uev1a?復合物。

4.按照權利要求1所述方法，其特征在于：所述的靶蛋白為人源DNA?聚合酶δ小亞基p12，并將其制備成帶GST標簽的融合蛋白用作泛素化反應體外分析系統中的基質。